荧光定量常见问题分析

荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。

②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。

2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。

② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。

③实时监测反应过程，定量更准确。

④定量范围宽，可达到10个数量级。

⑤可以实现一次反应检测多个样本。

3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。

②要严格防止气溶胶交叉污染。

采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。

③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。

④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。

⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。

⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。

⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。

4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。

②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。

③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。

④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。

荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。

②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。

2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。

② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。

③实时监测反应过程，定量更准确。

④定量范围宽，可达到10个数量级。

⑤可以实现一次反应检测多个样本。

3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。

②要严格防止气溶胶交叉污染。

采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。

③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。

④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。

⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。

⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。

⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。

4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。

②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。

③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。

④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。

荧光定量pcr实验常见问题梳理一、无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳，曲线不平滑:标准曲线线性差。

1.扩增产物大小不合适：实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间，如果调整反应的时间有可能扩增500bp的片段。

2.PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长：应根据扩增片段的大小予与调整。

3.MgCl,浓度不合适：按0. 5mm的间距调整MgCI2的浓度。

4.循环数设置不足：最少设置35个循环，可以增加到45个循环。

超过45个循环以上背景信号会增加，对实验结果的分析造成干扰。

5.在错误的PCR反应步骤采集信号：应检查程序设置确保信号的采集是在退火的步骤进行的。

6.加样的误差及错误：注意每次加样的一致性及移液器的校正。

7.DNA模板的起始浓度过低，不能被检测出来：如果模板的浓度未知，最初的实验可以采用较高浓度的模板并进行梯度稀释。

最高的模板浓度不超过500ng基因组DNA。

8.模板DNA的降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。

9.梯度稀释标准样品的方法不规范:应注意梯度稀释样品的操作规范，准确。

10.引物或探针设计有误，存在二级结构：通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR反应结果，是否有PCR产物存在。

如果没有PCR扩增产品，应使用引物设计软件检查引物的各种指标是否合适: Tm. 与模板的批配度、二级结构、扩增片段的长度、非特异型扩增的情况。

具体的数据请翻阅前面的相关原理说明11.引物之间的Tm值相差过多：上下游引物的Tm值差不应超过4C。

12.引物或探针的使用浓度不合适：应将浓度控制在50- 900 nM之间，探针的浓度低于引物的浓度。

13.引物或探针降解：使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解，检查DNA模板的储存条件是否合适，如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。

14.探针设计的位置在扩增片段的5’端：应将探针设计的位置靠近扩增片段的3”端15.探针被氧化：避免用酸性溶液溶解探针，否则会产生高背景荧光信号及低的扩增信号。

荧光定量PCR检测miRNA中遇到的常见问题
一、反转录引物(RT引物)设计
实时荧光定量PCR检测miRNA的难点在于如何识别只有22nt左右的miRNA并合成第一链，目前常用的方法主要有茎环法和加尾法。

茎环法：引物由可以自身呈茎环状的特异序列+6~8个miRNA3’端反向互补碱基组成。

该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸，这样就得到一个较长的反转录扩增子，为后续的荧光定量PCR提供了符合要求的模板。

原理示意图如下：
加尾法(Oligod(T)特异RT引物法)：RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的引物(由特异序列+(T)20左右+兼并碱基V或VN组成)。

加尾法特异性稍低，但设计及操作简单。

原理示意图如下：
二、荧光定量PCR引物探针设计
反转录后得到的cDNA为复合片段(miRNA+引物)，上游引物为特异性引物，在miRNA上设计，若GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGC等保护碱基，下游引物为通用引物，与RT引物的某一段相匹配。

荧光定量PCR检测方法主要有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。

前者需调整引物浓度，提高引物扩增效率，尽量减少引物二聚体与非特异性扩增;探针法需设计荧光探针，探针设计位置可以有3种：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉位置、完全在RT引物上。

至于探针要设计在哪个位置，可根据自己的实验情况来定。

荧光定量PCR常见问题分析荧光定量PCR常见问题分析Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。

设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

3.PCR产物太长。

一般采用80-150bp的产物长度。

Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。

一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。

2.检测荧光信号的步骤有误。

一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

3.引物或探针降解。

可通过PAGE电泳检测其完整性。

4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。

5.模板量不足。

对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

6.模板降解。

避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Q3．标准曲线的线性关系不佳1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。

2.标准品出现降解。

应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

3.引物或探针不佳。

重新设计更好的引物和探针4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高Q4．阴性对照也出现明显的起飞1.应mix或水被污染。

2.引物二聚体的出现。

用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。

3.反应过程中探针的降解。

用PAGE电泳对探针进行检测。

4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。

Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。

Q6．熔解曲线不止一个主峰1．引物设计不够优化。

应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

2.引物浓度不佳。

适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

3.镁离子浓度过高。

适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

荧光定量PCR问题疑难解答荧光定量PCR问题疑难解答（一）Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。

但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。

2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。

1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。

做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。

可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。

2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。

Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。

Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。

Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。

Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。

融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。

Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。

荧光定量PCR问题疑难解答（一）两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。

但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。

2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。

1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。

做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。

可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。

2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。

Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。

Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。

Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。

Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。

融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。

Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。

荧光定量PCR常见问题1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。

开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。

关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。

2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。

ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。

当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。

碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。

碎片整理的方法如下：∙在Windows桌面上，选择开始(start),我的电脑(My computer)。

∙在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。

∙在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。

∙单击碎片整理(Defragment)。

∙当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。

∙在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。

为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。

4.何时执行windows service pack更新？不要执行该操作。

除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。

荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。

然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。

本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。

一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。

引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。

引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。

- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。

- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。

- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。

2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。

这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。

二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。

选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。

TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。

2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。

以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。

- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。

三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。

其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。