蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室(精)

北京大学生物科学(本科类)生命科学学院（生物科学）生命科学是21世纪迅猛发展的学科，是当今最令人瞩目的前沿学科。

北京大学生命科学学院的前身是创办于1925年的北京大学生物学系，是我国高等学校中最早建立的生物学系之一。

新中国成立后集中了北大、燕大、清华三所大学生物学人材的精英，形成了北京大学生物学系，1993年又在原生物系的基础上建立生命科学学院。

数十年来，北京大学生命科学学院为国家培养了5000多名生物科学工作者，其中有27人成为中国科学院院士或中国工程院院士。

生命科学学院现有教授41人（院士3名，长江特聘教授8人，杰出青年基金获得者14人）、副教授24人、博士生导师39人；具有博士授予权的学科8个，硕士授予权的学科12个，同时是全国首批生物科学一级学科博士学位授予单位，并设有博士后科研流动站。

学院有生物化学、细胞生物学、植物学、动物学、生理学等5个国家重点学科；蛋白质工程及植物基因工程、生物膜及膜生物工程2个国家重点实验室。

教授及研究生主要从事细胞分化与细胞工程、非细胞体系核重建、模式生物发育机制、蛋白质结构与功能、蛋白质工程及蛋白质组学、核酸和基因工程及基因组学、基因表达控制、结构生物学、生物信息学、神经生理、生态学等多方面的研究。

学院是教育部的“国家理科生物学人才培养基地”和“国家生命科学与技术人才培养基地”，是目前国内综合实力最强的生命科学学院。

学院以生物科学专业招生，3年级开始按学生的志愿和成绩分为生物科学和生物技术2个专业，学制均为四年。

学院特别重视基础知识教育和实验技能的培养，专业基础课和专业课都由教授主持主讲。

学生将学习广泛的公共基础课，以及包括分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、生理学、植物生物学、动物生物学等生物学基础课和专业课。

学生除了掌握每门课程的实验技术外，还要在四年级选择模块化的综合实验课程，目的是加强培养学生的科学研究能力。

学校和生命科学学院还为学生提供了多种本科生科研基金，用于创新能力的培养，所有学生都在四年级时进行全面的毕业论文训练。

湖南师范大学特色专业湖南师范大学是全国著名的师范院校，国家“211工程”重点建设大学，全国师范院校综合实力稳居前十，在第七名上下波动。

2011年教育学学科（教育学包括教育学、体育学等2个学科类，共有9个本科专业）全国排名第十三。

第一选择还是文科类的师范类专业——中文、历史学、教育学、英语，还有新闻系也值得一提，在湖南省内较强。

物理、数学和化学也说得过去，此外，生命科学院的生物科技因为有一个院士和几个国家级实验室，值得考虑。

另外，还有几个国家特色专业（国家特色师范类专业）：体育教育、英语、生物科学、教育学、思想政治教育、化学、数学、物理学、历史学。

发育生物学学科湖南师范大学发育生物学学科点的发展始于上世纪50年代初的鱼类发育生物学研究，以刘筠院士为首的课题组在深入研究我国四大家鱼生殖细胞发育与受精规律的基础上，从理论上阐明了池塘条件下四大家鱼不能自然产卵的原因，为我国解决了四大家鱼人工繁殖过程中的关键技术和理论问题。

上世纪70年代，开展了中华鳖、乌龟、牛蛙生殖细胞的发育规律和人工繁殖研究，并大面积推广应用。

80年代以来，重点开展了多倍体鲫鲤的研究，在世界上首次获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤群体，利用四倍体鱼制备出的世界首例三倍体鱼并在全国28个省市推广应用，产生了重大社会、经济和生态效益。

自上世纪90年代以来, 本学科实现了跨越式发展，除继续开展鱼类发育生物学研究外，还开展了心脏发育、神经管发育、骨骼发育与细胞凋亡以及发育中的蛋白质组学等方面的研究，在国内外产生了较大的学术影响。

1996年，我校“鱼类发育生物学与蛋白质化学”获准立项成为国家“211工程”重点建设学科；2000年获得发育生物学博士学位授予权；2001年被确定为湖南省重点学科；2001年以梁宋平教授为主任的“蛋白质化学与鱼类发育生物学”实验室被批准为教育部重点实验室；2005年“长江学者”张健教授领衔的“动物重要器官发育的基因调控”获教育部“长江学者”创新团队计划资助；2006年“多倍体鱼繁殖及育种技术研究中心”被批准为教育部工程研究中心，刘少军教授任主任。

解冻冷门专业：生物科学未来的热点专业生物科学专业——未来的热点专业总有人说，二十一世纪是生物的世纪，生物学的前景相当广漠。

但是近几年，生物科学多次成为红牌专业，因为国内的生物行业还未成熟，医药行业仍是化学专业主导，所以本科生毕业大体找不到好工作，想做科研的话就要做好考研考博的准备。

其次，转行率极高，毕业后做什么的都有。

在这条路上，有太多半途放弃的人。

那么，什么样的孩子，才适合这个专业呢？一、学习内容生物科学专业包括了生物科学和生物技术两个专业方向，这些专业学科主要培育学生学习生物科学技术方面的大体理论、大体知识，学生将受到应用基础研究和技术开发方面的科学思维和科学实验训练，进而具有较好的科学素养及初步的教学、研究、开发与管理的大体能力。

其核心课程主要包括了动物生物学、植物生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、普通生态学等学科；必修课程则包括无机及分析化学、有机化学、大学数学、大学物理学、生物统计学、发育生物学、生物技术概论、进化生物学等。

高考院校库对于该专业的介绍是这样的：本专业学生主要学习生物科学方面的大体理论、大体知识，受到基础研究和应用基础研究方面的科学思维和科学实验训练，具有较好的科学素养及必然的教学、科研能力。

1.掌握数学、物理、化学等方面的大体理论和大体知识：2.掌握动物生物学、植物生物学、微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经生物学、分子生物学、生态学等方面的大体理论、大体知识和大体实验技术；3.了解相近专业的一般原理和知识：4.了解国家科技政策、知识产权等有关政策和法规：5.了解生物科学的理论前沿、应用前景和最新发展动态；6.掌握资料查询、文献检索及运用现代信息技术获取相关信息的大体方式；具有必然的实验设计，创造实验条件，归纳、整理、分析实验结果，撰写论文，参与学术交流的能力。

二、就业前景生物科学与工程专业本科生直接从事科研方面工作的可能性不大，部份毕业生转向其它行业，部份毕业生从事相关专业的下游技术工作。

湖南师范大学创建于1938年，位于历史文化名城长沙，是国家“211工程”重点建设的大学、教育部普通高等学校本科教学工作水平评估优秀高校。

学校现有5个校区，占地168公顷，建筑面积100余万平方米，主校区西偎麓山，东濒湘江，风光秀丽，是全国绿化“400佳”单位之一。

学校现有23个学院，3个教学部，本科和研究生专业覆盖哲、经、法、教、文、史、理、工、农、医、管等11个学科门类。

学校拥有发育生物学等6个“十一五”国家重点学科、伦理学等9个“211工程”“三期”重点建设学科和生物化学与分子生物学等18个“十一五”省级重点学科，10个博士后科研流动站，5个一级学科博士点、55个二级学科博士点，18个一级学科硕士点、147个二级学科硕士点、8个专业硕士学位及高等学校教师和中等职业学校教师在职攻读硕士学位授予权，74个本科专业；拥有教育部人文社会科学重点研究基地--湖南师范大学道德文化研究中心、中国语言文学和历史学两个国家文科基础学科人才培养和科学研究基地、国家生命科学与技术人才培养基地、全国大学生文化素质教育基地、教育部基础教育课程研究湖南师范大学中心等13个国家级人才培养和科学研究基地（中心）；拥有蛋白质组学与发育生物学省部共建国家重点实验室培育基地，蛋白质化学与鱼类发育生物学、化学生物学与中药分析、低微量子结构与调控教育部重点实验室，多倍体繁殖与育种技术教育部工程研究中心，微生物分子生物学、蛋白质组学与发育生物学湖南省重点实验室等7个国家和部省级科技创新平台以及微生物学与生物技术湖南省高校重点实验室。

学校现有专任教师1600多人。

其中中国科学院院士1人，中国工程院院士1人，“长江学者奖励计划”人选4人，国家级教学团队2个，教育部“长江学者与创新团队发展计划”科研团队１个；国家“百千万人才工程”人选5人、享受国务院政府特殊津贴84人；国家有突出贡献的中青年专家7人、国家自然科学杰出青年基金获得者4人；国家教学名师3人；教育部“跨世纪优秀人才计划”、“新世纪优秀人才支持计划”、“高等学校骨干教师资助计划”、“优秀青年教师资助计划”、“高校青年教师奖”获得者25人；湖南省“芙蓉学者”、“121人才工程”人选、“普通高等学校学科带头人”培养对象100人；湖南师范大学“潇湘学者”特聘教授17人；学校先后同10多个国家和地区的70多所大学建立了合作与交流关系，积极引进人才、智力和资金，开展科研合作。

湖南师范⼤学钱钟书笔下的“三闾⼤学” 湖南师范⼤学地处岳麓⼭下，与湖南⼤学毗邻。

沿着⼭路从爱晚亭下⾏⼗⼏分钟，拐过⼀个弯就是湖师⼤的地界了。

相⽐之下，湖南师⼤在清幽上更胜⼀筹，处处绿树掩映。

泛出新绿的草地上，三三两两坐着读书的学⽣。

他们脸上透着⼀股端庄凝重之⽓。

毕业后，他们中的很多⼈将⾛上三尺讲台，成为传道授业的⼈民教师。

⾸批进⼊ “211”重点建设⾏列 1938年，湖南蓝⽥，国⽴师范学院在抗⽇烽⽕中诞⽣。

这就是湖南师⼤的前⾝。

钱钟书在长篇⼩说《围城》中描写的“三闾⼤学”原型就是这⾥。

那时，这⾥群英荟萃——钱钟书、沈同洽、徐燕谋、罗暟岚、刘重德、赵甄陶、张⽂庭等众多知名学者先后执教于此。

1984年，学校更名为湖南师范⼤学，1996年成为国家⾸批“211⼯程”重点建设⼤学，后⼜合并了湖南教育学院、湖南政法管理⼲部学院和湖南医学⾼等专科学校。

⽬前，学校共有74个本科专业，以⽂学、历史、外语、数学、物理、化学、⽣物等⽂理基础学科见长，⾳体美和教育类专业在当地颇有影响。

学校拥有教育部⼈⽂社会科学重点研究基地——道德⽂化研究中⼼、中国语⾔⽂学和历史学国家⽂科基础学科⼈才培养和科学研究基地、国家⽣命科学与技术⼈才培养基地等13个⼈才培养和科学研究基地(中⼼)，还拥有蛋⽩质组学与发育⽣物学省部共建国家重点实验室培育基地以及蛋⽩质化学与鱼类发育⽣物学等7个国家和部省级科技创新平台。

有的家长误认为湖南师⼤只是培养教师的学校。

事实上，学校近年已在向综合型⼤学⽅向发展。

⽬前，在校⾮师范⽣的⽐例已超过50%。

学校允许师范类与⾮师范类学⽣互通。

学⽣在校学习⼀两年内，可转专业。

湖南师范⼤学副校长黎⼤志介绍，如果学⽣想转专业，只要提出申请并有正当理由，学校经考核后会尽量满⾜学⽣意愿。

如有些学⽣表⽰“学该专业有基础”、“学此专业好就业”、“对当⽼师感兴趣”等，经学校认可后都能转专业。

据了解，每⼀届都有近10%的学⽣转专业。

中国教育和科研计算机网移动通信国家重点实验室（东南大学）工业心理学国家专业实验室（浙江大学）现代光学仪器国家重点实验室（浙江大学）工业控制技术国家重点实验室（浙江大学）海岸和近海工程国家重点实验室（大连理工大学）爆炸灾害预防、控制国家重点实验室（北京理工大学）微米、纳米加工技术国家重点实验室（北京大学）基因工程教育部重点实验室（中山大学）晶体材料国家重点实验室（山东大学）先进材料教育部开放实验室（清华大学）应用有机化学重点实验室（兰州大学）制浆造纸工程国家重点实验室(华南理工大学)农业生物技术国家重点实验室（中国农业大学）东南大学分子与生物分子电子学重点实验室电力设备电气绝缘国家重点实验室（西安交通大学）区域光纤通信网与新型光通信系统国家重点实验室（上海交通大学）电子物理与器件国家专项实验室（西安交通大学）生物传感器技术国家专业实验室（浙江大学）硅材料国家重点实验室（浙江大学）二次资源化工国家专业实验室（浙江大学）金属基复合材料国家重点实验室（上海交通大学）机械制造系统工程国家重点实验室（西安交通大学）电力电子技术国家专业实验室（浙江大学）吉林大学超硬材料国家重点实验室作物遗传改良国家重点实验室大气环境模拟国家重点实验室（北京大学）晶体材料国家重点实验室（山东大学）阻燃材料研究重点学科点专业实验室（北京理工大学）植被生态科学教育部重点实验室（东北师范大学）东南大学吴健雄实验室、分子与生物分子电子学教育部重点实验室塑性成形模拟及模具技术国家重点实验室（华中科技大学）新型电机国家专业实验室（华中科技大学）海洋工程国家重点实验室（上海交通大学）高纯硅及硅烷国家重点实验室（浙江大学）机械传动国家重点实验室（重庆大学）生物防治国家重点实验室（中山大学）新金属材料国家重点实验室（北京科技大学）作物遗传与特异种质创新教育部重点实验室（南京农业大学）超硬材料国家重点实验室（吉林大学）中国农业大学农业生物技术国家重点实验室海岸和近海工程国家重点实验室（大连理工大学）湍流与复杂系统研究国家重点实验室（北京大学）薄膜与微细技术教育部重点实验室（上海交通大学）聚合反应工程国家重点实验室（浙江大学）信号采集与处理重点学科点专业实验室（北京理工大学）机器视觉听觉信息处理国家重点实验室（北京大学）暴雨监测与预测国家重点实验室（北京大学）煤燃烧国家重点实验室（华中科技大学）光电技术及系统开放实验室（重庆大学）汽车动力性及排放测试重点学科点专业实验室（北京理工大学）材料复合新技术国家重点实验室（武汉理工大学）卫生部抗感染药物临床药理基地（北京大学）聚合物成型加工工程教育部重点实验室(华南理工大学)机械学及机器人机构重点实验室（北京航空航天大学）直升机旋翼动力学国家级重点实验室（南京航空航天大学）一碳化学与化工国家重点实验室复旦大学应用表面物理国家重点实验室医学免疫学卫生部重点实验室（北京大学）电力系统及发电设备安全控制和仿真国家重点实验室（清华大学）摩擦学国家重点实验室(清华大学)单原子分子测控教育部重点实验室（清华大学）机械结构强度与振动国家重点实验室（西安交通大学）生物力学与组织工程教育部重点实验室（重庆大学）复旦大学应用表面物理国家重点实验室山东大学晶体材料国家重点实验室卫生部精神卫生重点实验室（北京大学）结构工程与振动教育部重点实验室（清华大学）轧制技术及连轧自动化国家重点实验室（东北大学）振动、冲击、噪声国家重点实验室（上海交通大学）颜色科学与工程国家重点学科点专业实验室（北京理工大学）生育健康部级重点实验室（北京大学）肾脏疾病卫生部重点实验室（北京大学）凝固技术国家重点实验室（西北工业大学）高速水力学国家重点实验室（四川大学）中国科学院学部中国科学院黄土与第四纪地质国家重点实验室计算机辅助设计与图形学国家重点实验室（浙江大学）曲阜师范大学激光研究所中国科学院西安精密机械研究所中国科学院大连化学物理研究所燃料电池工程中心重庆大学机械传动国家重点实验室“油气藏地质与开发工程”国家重点实验室固体微结构物理国家重点实验室清华大学计算机硬件实验室金属材料强度国家重点实验室精细功能电子材料与器件国家专业实验室湍流研究国家重点实验室中国科技大学快电子学实验室雷达信号处理国家重点实验室超快速激光光谱学国家重点实验室中国科学院陕西天文台中国科学院西双版纳热带植物园中国科学院西安分院中国科学院长沙农业现代化研究所中科院昆明动物研究所中国科学院地理研究所中国科学院发育生物学研究所中国科学院成都图书馆（成都文献情报中心）中国科学院长沙大地构造研究所中国科学院发育生物学研究所植物发育分子生物学研究室中国科学院海北高寒草甸生态系统实验站中科院数字地图制作与服务中心中国科学院地球化学研究所流体传动及控制国家重点实验室（浙江大学）超硬材料国家重点实验室蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室配位化学国家重点实验室有机地球化学国家重点实验室中国科大量子通信与量子计算开放实验室内生金属矿床成矿机制研究国家重点实验室近代声学国家重点实验室分子动态及稳定态结构国家重点实验室清华大学新型陶瓷与精细工艺国家重点实验室机械制造系统工程国家重点实验室机械结构强度与振动国家重点实验室（西安交通大学）动力工程多相流国家重点实验室（西安交通大学）STATE KEY LABORATORY OF SOLIDIFICATION PROCESSING兰州大学干旱农业生态国家重点实验室天然药物及仿生药物国家重点实验室（北京大学）轧制技术及连轧自动化国家重点实验室西南交通大学牵引动力国家重点实验室中尺度灾害性天气国家专业实验室（南京大学）污染控制与资源化研究国家重点实验室（南京大学）海岸与海岛开发国家专业（试点）实验室（南京大学）软件工程国家重点实验室（武汉大学）测绘遥感信息工程国家重点实验室（武汉大学）信息光学教育部重点实验室（北京理工大学）超快速激光光谱学国家重点实验室（中山大学）胶体与界面化学教育部重点实验室（山东大学）南京大学固体微结构国家重点实验室南京大学固体微结构物理国家重点实验室农业部茶叶生物技术重点开放实验室中国科学院半导体研究所农业部茶叶生物技术重点开放实验室理论化学计算国家重点实验室。

二倍体雌核发育鲫鲤卵子发生的DNA含量和细胞学分析张纯;刘少军;伍艳红;刘筠【摘要】以产生单倍体卵子的二倍体雌性红鲫为对照,对远缘杂交起源的二倍体雌核发育鲫鲤早期卵巢组织中的生殖细胞进行了流式细胞术分析,在此基础上结合组织学切片方法和染色体制片,对相应的卵巢组织细胞学观察和生殖细胞减数分裂特征进行了探讨.结果显示,雌核发育二倍体鲫鲤卵母细胞的DNA含量呈现两个主要的峰值,检测样本中的2号峰值显示的DNA含量是二倍体红鲫卵母细胞的1倍,代表减数分裂前染色体数未加倍的细胞群,其减数分裂Ⅰ前期分裂相呈现同源染色体部分配对,该细胞群在组织学切片上呈现空泡化等败育现象;另外,检测样本中的3号峰值显示的DNA含量是二倍体红鲫卵母细胞的2倍,代表减数分裂前染色体数已加倍的细胞群,其减数分裂Ⅰ前期分裂相呈现染色体数目加倍的完整的染色体配对,该细胞群由于染色体数加倍,可以越过杂种鱼的异源染色体之间的减数分裂配对障碍,正常发育为体积不断增大的初级卵母细胞,为产生后续的染色体数不减半的二倍体卵子奠定基础.该结果丰富了不减数配子的发生机制研究,在鱼类遗传育种方面具有重要意义.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2015(039)001【总页数】7页(P1-7)【关键词】二倍体杂种鱼;卵母细胞;减数分裂;不减数配子;流式细胞术【作者】张纯;刘少军;伍艳红;刘筠【作者单位】湖南师范大学生命科学学院,教育部蛋白质化学与鱼类发育生物学重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,教育部蛋白质化学与鱼类发育生物学重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,教育部蛋白质化学与鱼类发育生物学重点实验室,湖南长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,教育部蛋白质化学与鱼类发育生物学重点实验室,湖南长沙410081【正文语种】中文【中图分类】Q321+.3;S917.4红鲫(Carassius auratus red var.)和鲤(Cyprinus carpio)远缘杂交形成的异源四倍体鲫鲤可以稳定地产生二倍体卵子和二倍体精子,保证了其四倍体性代代相传,目前已经繁殖到F22,形成了数量庞大且遗传性状稳定的异源四倍体鲫鲤群体[1-4]。

发育生物学学科简介1、本学科的历史沿革与现状概述湖南师范大学发育生物学学科点的发展始于上世纪50年代初的鱼类发育生物学研究，以刘筠院士为首的课题组在深入研究我国四大家鱼生殖细胞发育与受精规律的基础上，从理论上阐明了池塘条件下四大家鱼不能自然产卵的原因，为我国解决了四大家鱼人工繁殖过程中的关键技术和理论问题。

上世纪70年代，开展了中华鳖、乌龟、牛蛙生殖细胞的发育规律和人工繁殖研究，并大面积推广应用。

80年代以来，重点开展了多倍体鲫鲤的研究，在世界上首次获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤群体，利用四倍体鱼制备出的世界首例三倍体鱼并在全国28个省市推广应用，产生了重大社会、经济和生态效益。

自上世纪90年代以来, 本学科实现了跨越式发展，除继续开展鱼类发育生物学研究外，还开展了心脏发育、神经管发育、骨骼发育与细胞凋亡以及发育中的蛋白质组学等方面的研究，在国内外产生了较大的学术影响。

1996年，我校“鱼类发育生物学与蛋白质化学”获准立项成为国家“211工程”重点建设学科；2000年获得发育生物学博士学位授予权；2001年被确定为湖南省重点学科；2001年以梁宋平教授为主任的“蛋白质化学与鱼类发育生物学”实验室被批准为教育部重点实验室；2005年“长江学者”张健教授领衔的“动物重要器官发育的基因调控”获教育部“长江学者”创新团队计划资助；2006年“多倍体鱼繁殖及育种技术研究中心”被批准为教育部工程研究中心，刘少军教授任主任。

本学科现已形成了以刘筠院士为学科带头人，一批年青学者为学术骨干的研究团队，凝炼了一批具有鲜明特色，处于学科发展前沿的研究方向；承担了一批包括国家“973”子项目、国家“863“项目、国家杰出青年基金、国家自然科学基金重点项目、教育部创新团队计划项目、国家发改委高技术产业化项目在内的国家级科技项目，具备了进行高水平研究的技术平台和培养高质量人才的条件。

本学科的学科带头人刘筠教授为中国工程院院士，博士生导师。

教育部重点实验室名录教育部重点实验室：是国家科技创新体系的重要组成部分、高等学校创新性人才的培养基地，在高校学科建设、科技创新、人才培养和培育国家级科研基地中发挥着越来越重要的作用。

1.北京大学地表过程分析与模拟、造山带与地壳演化、神经科学、分子心血管、生物有机分子工程、数学及其应用、纳米器件物理与化学、水沙科学、细胞增殖与分化、恶性肿瘤发病机制及转化研究、高分子化学与物理、视觉损伤与修复、辅助生殖、机器感知与智能、慢性肾脏病防治、数量经济与数理金融、高可信软件技术2.清华大学工业生物催化、应用力学、地球系统数值模拟、蛋白质科学、生物信息学、普适计算、粒子技术与辐射成像、信息系统安全、生态规划与绿色建筑、土木工程安全与耐久、固体废物资源化及应急控制工程、先进成形制造、热科学与动力工程、先进反应堆工程与安全、先进材料、有机光电子及分子工程3.北京交通大学全光网络与现代通讯网、发光与光信息技术、城市交通复杂系统理论与技术、城市地下工程、先进制造与测控技术(B类)4.北京工业大学传热强化与过程节能、新型功能材料5.北京航空航天大学流体力学6.北京科技大学环境断裂、金属矿山高效开采与安全、钢铁流程先进控制、材料先进制备技术、腐蚀与防护7.北京邮电大学泛网无线通信、可信分布式计算与服务8.北京化工大学纳米材料先进制备技术与应用科学、可控化学反应科学与技术基础9.中国农业大学植物-土壤相互作用、现代精细农业系统集成研究、作物杂种优势研究与利用10.北京林业大学水土保持与荒漠化防治、林木、花卉遗传育种11.北京师范大学环境演变与自然灾害、细胞增殖及调控生物学、射线束材料改性、水沙科学、生物多样性与生态工程、放射性药物实验室、教学与复杂系统、理论与计算化学12.北京中医药大学中医内科实验室、中医药抗病毒实验室、中医养生学实验室13.南开大学生物活性材料、核心数学与组合数学、光电信息技术科学、功能高分子材料、弱光非线性光子学、分子微生物学与技术、环境污染过程与基准、先进能源材料化学14.天津大学绿色合成与转化、先进陶瓷与加工技术、光电信息技术科学、电力系统仿真控制、港口与海洋工程、定量系统生物工程15.中北大学仪器科学与动态测试16.山西大学化学生物学与分子工程、计算智能与中文信息处理17.太原理工大学煤科学与技术、新型传感器与智能控制、材料界面科学与工程、原位改性采矿(省部共建)18.内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术19.东北大学材料电磁过程研究、材料各向异性设计与织构工程20.吉林大学符号计算与知识工程、汽车材料、分子酶学工程、病理生物学、东北亚生物演化、工程仿生、地球信息探测仪器、人兽共患病研究、相干光与原子分析光谱、地下水资源与环境21.东北师范大学植被生态学、多酸科学、应用统计、分子表观遗传学、紫外光发射材料与技术22.复旦大学医学分子病毒学、分子医学、聚合物分子工程、非线性数学模型与方法、应用离子束物理、癌变与侵袭原理、现代人类学、生物多样性与生态工程、波散射与遥感信息、公共卫生安全23.同济大学道路与交通工程、长江水环境、先进土木工程材料、嵌入式系统与服务计算、岩土及地下工程、高密度人居环境生态与节能24.上海交通大学动力机械与工程、薄膜与微细技术、微生物代谢工程、系统控制与信息处理(筹)、功能基因组学和人类疾病相关基因研究教育部重点实验室、细胞分化与凋亡教育部重点实验室、系统生物医学教育部重点实验室(筹)、电力工程新技术教育部重点实验室25.华东理工大学超细材料制备与应用、系统承压安全科学、化工过程先进控制和优化技术、结构可控先进功能材料及其制备、特种功能高分子材料及相关技术26.东华大学纺织面料技术、生态纺织27.华东师范大学脑功能基因组学、地理信息科学、极化材料与器件、言语听觉科学(筹)、青少年健康评价与运动干预(筹)28.上海交通大学医学院功能基因组学和人类疾病相关基因研究、细胞分化与凋亡29.南京大学海岸与海岛开发、中尺度灾害性天气、介观材料、近代声学、生命分析化学30.东南大学微电子机械系统(MEMS)、计算机网络和信息集成、混凝土及预应力混凝土结构、发育与疾病相关基因、儿童发展与学习科学、能源热转换及其过程测控、复杂工程系统测量与控制31.中国矿业大学煤炭资源、煤炭加工与高效洁净利用、煤层气资源与成藏32.河海大学海岸灾害及防护、浅水湖泊综合治理与资源开发、岩土力学与堤坝工程、南方地区高效灌排与农业水土环境33.江南大学食品胶体与生物技术、工业生物技术、轻工过程先进控制、生态纺织、糖化学与生物技术34.浙江大学生物医学工程、濒危野生动物保护遗传与繁殖、动物分子营养学、污染环境修复与生态健康、视觉感知、高分子合成与功能构造、软弱土与环境土工、恶性肿瘤预警与干预、生殖遗传35.合肥工业大学特种显示技术、过程优化与智能决策36.安徽大学光电信息获取与控制37.厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程、现代分析科学、海洋环境科学、水声通信与海洋信息技术、亚热带湿地生态学38.南昌大学食品科学与安全、食品科学39.山东大学实验畸形学、心血管重构与功能研究、胶体与界面化学、材料液固结构演变与加工、密码技术与信息安全、生殖内分泌40.中国海洋大学物理海洋、海洋药物、海水养殖、海洋环境与生态、海底科学与探测技术、海洋化学理论与工程技术、海洋生物遗传学与育种41.中国石油大学石油工程42.郑州大学材料物理、材料成形过程与模具43.武汉大学地球空间环境与大地测量、发育生物学、生物医用高分子材料、水沙科学、口腔生物医学工程、声光材料与器件44.华中科技大学图像信息处理与智能控制、智能制造技术、信息存储系统、生物医学光子学、基本物理量测量、器官移植、环境与健康、聚变与电磁新技术、服务计算技术与系统、分子生物物理、神经系统重大疾病、生物靶向治疗、肿瘤侵袭转移45.武汉理工大学光纤传感技术与信息处理、高速船舶工程46.中国地质大学岩石圈构造深部过程及探测技术、地下信息探测技术与仪器47.华中农业大学园艺植物生物学、农业动物遗传育种与繁殖48.中南大学重载铁路工程结构、糖尿病免疫学、有色金属成矿预测、有色金属资源化学、轨道交通安全、生物冶金、癌变与侵袭原理、有色金属材料与工程49.湖南大学环境生物与控制50.湖南师范大学蛋白质化学与鱼类发育生物学、化学生物学及中药分析、低微量子结构与调控(省部共建)、高性能计算与随机信息处理(省部共建) 51.中山大学基因工程、聚合物复合材料及功能材料、生物无机与合成化学、智能传感器网络、信息技术、水产品安全(筹)52.华南理工大学聚合物成型加工工程、传热强化与过程节能、特种功能材料、亚热带建筑、工业聚集区污染控制与生态修复、自主系统与网络控制53.暨南大学重大工程灾害与控制、再生医学54.汕头大学智能制造技术55.广西大学微生物及植物遗传工程、有色金属及材料加工新技术、工程防灾与结构安全56.重庆大学光电技术及系统、高电压与电工新技术、西南资源开发及环境灾害控制工程、三峡库区生态环境、山地城镇建设与新技术、工业CT无损检测、生物流变科学与技术、低品位能源利用技术及系统、信息物理社会可信服务计算、飞行器测控与通信57.四川大学人类疾病生物治疗、皮革化学与工程、辐射物理及技术、生物资源与生态环境、口腔生物医学工程、靶向药物、绿色化学与技术58.电子科技大学综合电子系统技术(B类)、神经信息、光纤传感与通信、光电探测与传感集成技术(B类)59.云南大学自然资源药物化学、微生物可持续利用60.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制、普洱茶学61.西安交通大学物质非平衡合成与调控、过程控制与效率工程、现代设计及转子轴承系统、电子物理与器件、电子陶瓷与器件、生物医学信息工程、环境与疾病相关基因、智能网络与网络安全、热流科学与工程62.西北大学西部资源生物与现代生物技术63.西北工业大学现代设计与集成制造技术、空间应用物理与化学64.西安电子科技大学智能感知与图像理解、计算机网络与信息安全、电子装备结构设计、宽禁带与半导体材料与器件、电子信息技术防攻对抗与仿真技术、超高速电路设计与电磁兼容65.西北农林科技大学植保资源与病虫害治理、旱区农业水土工程、西部环境与生态66.长安大学特殊地区公路工程67.兰州大学西部环境、磁学与磁性材料、干旱与草地生态、西部灾害与环境力学、半干旱气候变化68.中国人民大学数据工程与知识工程69.北京理工大学复杂系统智能控制与决策70.中国政法大学证据科学71.哈尔滨工程大学超轻材料与表面技术72.东北林业大学森林植物生态学、生物质材料科学与技术、东北油田盐碱植被恢复与重建73.东北师范大学植被生态科学、多酸科学、应用统计、分子表观遗传学、紫外光发射材料与技术74.大连理工大学三束材料改性75.海军军医大学分子神经生物学76.南京农业大学肉品加工与质量控制、农作物生物灾害综合治理77.中国药科大学现代中药78.南京航空航天大学飞行器结构力学与控制79.西南交通大学材料先进技术、磁浮技术与磁浮列车、高速铁路线路工程80.陆军军医大学高原医学81.华中师范大学农药与化学生物学82.南京理工大学功能纳米晶83.北京信息科技大学(省部共建)现代测控技术84.浙江工业大学特种装备制造与先进加工技术、制药工程85.天津科技大学工业发酵微生物、食品营养与安全86.哈尔滨理工大学工程电介质及其应用87.哈尔滨医科大学(省部共建)心血管药物研究88.云南大学西南微生物多样性89.山西师范大学磁性分子与磁信息材料90.武汉纺织大学新型纺织材料绿色加工及其功能化91.天津科技大学工业发酵微生物、食品营养与安全92.天津理工大学显示材料与光电器件、计算机视觉与系统93.武汉工程大学绿色化工过程94.武汉科技大学钢铁冶金及资源利用95.华南农业大学南方农业机械与装备关键技术96.河南师范大学黄淮水环境与污染防治、绿色化学介质与反应、绿色化学与技术97.沈阳农业大学设施园艺、北方粳稻遗传育种98.湖北大学功能材料绿色制备与应用、有机功能分子合成与应用99.湖北工业大学发酵工程100.湖北中医药大学中药资源与中药复方101.齐鲁工业大学制浆造纸科学与技术102.山东师范大学分子与纳米探针103.首都师范大学三维信息获取与应用、赫兹光电子学。

教育部重点实验室名单序号实验室名称依托高校省区市分布1 纳米器件物理与化学北京大学北京2 生物有机分子工程北京大学北京3 重离子物理北京大学北京4 数学及应用数学北京大学北京5 地表过程分析与模拟北京大学北京6 造山带与地壳演化北京大学北京7 神经科学北京大学北京8 分子心血管学北京大学北京9 量子信息与测量北京大学清华大学 北京10 普适计算清华大学北京11 先进材料清华大学北京12 破坏力学清华大学北京13 结构工程与振动清华大学北京14 先进反应堆工程与安全清华大学北京15 生命有机磷化学及化学生物学清华大学北京16 有机光电子与分子工程清华大学北京17 原子分子纳米科学清华大学北京北京、湖北清华大学、北京大学18 水沙科学北京师范大学、武汉大学19 蛋白质科学清华大学北京20 生物信息学清华大学北京21 热科学与动力工程清华大学北京22 射线束技术与材料改性北京师范大学北京23 环境演变与自然灾害北京师范大学北京24 细胞增殖及调控生物学北京师范大学北京25 虚拟现实新技术北京航空航天大学北京26 流体力学北京航空航天大学北京27 植物--土壤相互作用中国农业大学北京28 现代精细农业系统集成研究中国农业大学北京29 可控化学反应科学与技术基础北京化工大学北京30 交通运输智能技术与系统北京交通大学北京31 环境断裂北京科技大学北京32 水土保持与荒漠化防治北京林业大学北京33 林木、花卉遗传育种北京林业大学北京34 新型功能材料北京工业大学北京35 全光网络与现代通讯网北京交通大学北京36 信息管理与信息经济学北京邮电大学北京37 光通信与光波技术北京邮电大学北京38 中医内科学北京中医药大学北京39 石油天然气成藏机理中国石油大学北京40 煤炭资源中国矿业大学北京41 生物活性材料南开大学天津42 核心数学与组合数学南开大学天津43 光电信息技术科学南开大学天津大学天津44 功能高分子材料南开大学天津45 先进陶瓷与加工技术天津大学天津46 绿色合成与转化天津大学天津47 化学生物学与分子工程山西大学山西48 煤科学与技术太原理工大学山西49 仪器科学与动态测试中北大学山西50 哺乳动物生殖生物学及生物技术内蒙古大学内蒙古51 符号计算与知识工程吉林大学吉林52 汽车材料吉林大学吉林53 地面机械仿生技术吉林大学吉林54 超分子结构与材料吉林大学吉林55 分子酶学工程吉林大学吉林56 病理生物学吉林大学吉林57 材料电磁过程研究东北大学辽宁58 森林植物生态学东北林业大学黑龙江59 植被生态科学东北师范大学黑龙江60 材料液态结构及其遗传性山东大学山东61 胶体与界面化学山东大学山东62 实验畸形学山东大学山东63 物理海洋中国海洋大学山东64 海水养殖中国海洋大学山东65 海洋遥感信息处理中国海洋大学山东66 聚合物分子工程复旦大学上海67 应用离子束物理复旦大学上海68 非线性数学模型与方法复旦大学上海69 医学分子病毒学复旦大学上海70 分子医学复旦大学上海71 生物多样性与生态工程复旦大学北京师范大学上海72 癌变与侵袭原理复旦大学中南大学上海73 薄膜与微细技术上海交通大学上海74 高温材料及高温测试上海交通大学上海75 动力机械与工程上海交通大学上海76 道路与交通工程同济大学上海77 先进土木工程材料同济大学上海78 超细材料制备与应用华东理工大学上海79 光谱学与波谱学华东师范大学上海80 地理信息科学华东师范大学上海81 脑功能基因组学华东师范大学上海82 纺织面料技术东华大学上海83 介观化学南京大学江苏84 海岸与海岛开发南京大学江苏85 中尺度灾害性天气南京大学江苏86 计算机网络和信息集成东南大学江苏87 微电子机械系统东南大学江苏88 洁净煤发电及燃烧技术东南大学江苏89 混凝土及预应力混凝土结构东南大学江苏90 发育与疾病相关基因东南大学江苏91 生物医学工程浙江大学浙江92 濒危野生动物保护遗传与繁殖浙江大学浙江93 动物分子营养学浙江大学浙江94 计算智能与信号处理安徽大学安徽95 工业生物技术江南大学江苏96 食品科学南昌大学江西97 生物医用高分子材料武汉大学湖北98 地球空间环境与大地测量武汉大学湖北99 植物发育生物学武汉大学湖北100 智能制造技术华中科技大学湖北101 图象信息处理与智能控制华中科技大学湖北102 信息存储系统华中科技大学湖北103 基本物理量测量华中科技大学湖北104 生物医学光子学华中科技大学湖北105 器官移植华中科技大学湖北106 环境与健康华中科技大学湖北107 园艺植物生物学华中农业大学湖北108 硅酸盐材料工程武汉理工大学湖北109 现代车身技术湖南大学湖南110 蛋白质化学及鱼类发育生物学湖南师范大学湖南111 有色金属材料科学与工程中南大学湖南112 轨道交通安全中南大学湖南113 生物冶金中南大学湖南114 材料物理郑州大学河南115 聚合物复合材料及功能材料中山大学广东116 基因工程中山大学广东117 眼科学中山大学广东118 聚合物成型加工工程华南理工大学广东119 传热强化与过程节能华南理工大学广东120 现代分析科学厦门大学福建121 细胞生物学与肿瘤细胞厦门大学福建122 智能制造技术汕头大学广东123 电子物理与器件西安交通大学陕西124 生物医学信息工程西安交通大学陕西125 电子陶瓷与器件西安交通大学陕西126 现代设计及转子轴承系统西安交通大学陕西127 环境与疾病相关基因西安交通大学陕西128 结构强度与振动西安交通大学陕西129 现代设计与集成制造技术西北工业大学陕西130 计算机网络与信息安全西安电子科技大学陕西131 特殊地区公路工程长安大学陕西132 大陆动力学西北大学陕西133 旱区农业水土工程西北农林科技大学陕西134 植保资源与病虫害治理西北农林科技大学陕西135 磁学与磁性材料兰州大学甘肃136 西部环境兰州大学甘肃137 干旱与草地生态兰州大学甘肃138 光电技术与智能控制兰州交通大学甘肃139 光电技术及系统重庆大学重庆140 高电压与电工新技术重庆大学重庆141 西南资源开发及环境灾害控制工程重庆大学重庆142 皮革化学与工程四川大学四川143 辐射物理及技术四川大学四川144 生物资源与生态环境四川大学四川145 口腔生物医学工程四川大学、武汉大学四川、湖北146 新型传感器电子科技大学四川147 宽带光纤传输与通信系统技术电子科技大学四川148 农业生物资源生物多样性与病害控制云南农业大学云南149 微生物与植物遗传工程广西大学广西。

2010年3月第33卷第1期 湖南师范大学自然科学学报Journal of Natural Science of Hunan Nor mal UniversityVol.33　No.1M ar.,2010斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析朱　婷,黄　文,王跃群,李永青,袁婺洲,莫小阳,万永奇,吴秀山,邓　云3 (湖南师范大学蛋白质化学及鱼类发育生物学教育部重点实验室心脏发育研究中心,中国长沙　410081)摘　要　为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT2PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX24T21中,并通过I PTG诱导表达出GST2Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western bl otting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;I PTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得S DS2P AGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.关键词　hand2;斑马鱼;原核表达;多克隆抗体中图分类号　Q812 文献标识码　A 文章编号　100022537(2010)0120108206C l o n i ng and Po l yc l o na l An ti bo dy P rep a ra ti o n o f hand2Gene i n Zeb rafishZHU Ting,HUAN G W en,WAN G Yue2qun,L I Yong2qing,YUAN W u2zhou,MO X iao2yang,WAN Yong2qi,WU X iu2shan,D EN G Yun3(The Center f or Heart Devel opment,Key Lab of MOE f or Devel opment B i ol ogy and Pr otein Che m istry,Hunan Nor mal University,Changsha410081,China)Abstract　The hand2gene in zebrafish is cl oned by bi oinf or matics combined with RT2PCR technique,then hand2frag ment is inserted int o pGEX24T21vect or.The GST2Hand2fusi on p r otein is induced by I PTG.After puri2 ficati on by GST affinity chr o mat ography,GST2Hand2fusi on p r otein is used t o i m mune the Ne w Zealand white rab2 bits t o p repare polycl onal antibody.The antibody is assayed by western bl otting and i m munohist oche m istry.The re2 sults show that zebrafish hand2gene coding regi on has627bp,which encods208a m ino acids,has83%identifica2 ti on with hu man Hand2gene.The GST2Hand2fusi on p r otein exp ressed in BL21accounts for71%of the t otal p r o2 teins.The GST2Hand2fusi on p r otein dis p lays a single strap in S DS–P AGE after purificati on,whose molecular mass is49000.The report de monstrates that the antibody has high sensitivity and s pecificity.Key words　hand2;zebrafish;p r okaryotic exp ressi on;polycl onal antibody已有文献表明:碱性螺旋2环2螺旋(basic helix2l oop2helix,bHLH)转录因子对骨骼肌细胞[1]、造血细胞[2]及一些神经元细胞[3]的分化起重要调节作用;也有bHLH家族成员与心脏及其他组织中的表达,肌细胞的发生、细胞增殖、组织分化以及其他重要的发育过程有关.Hand基因就是bHLH家族成员之一[4].近来有文献报道hand基因对心脏发育有非常重要的调节作用,在心脏的发生过程中与外胚中胚层、心管和心室的发育3收稿日期:2009212215基金项目:国家自然科学基金资助项目(30671137);湖南省教育厅优秀青年资助项目(06B053)3通讯作者,E2mail:dengyun2008@有关.其中,hand 2(又称dhand )主要在右心室和蜕膜中表达[5].剔除hand 2等位基因,纯合子胚胎不能形成右心室[6].在缺失hand 2的小鼠胚胎中,脉管系统不能正常形成[7].Hand 2很可能是通过VEGF 信号途径在血管发育和发生调控中起着重要的作用.另外,hand 2的表达又受骨形成蛋白(BMPs )调控[8],且能在鳃弓神经嵴中表达,维持颅面结构和动脉弓的形状[9].近年来研究发现hand 2对于胚胎发育十分重要,其功能异常与人类一些先天性异常综合征相关(如22q11缺失综合征、DGS 综合征、CAT CH222综合征等)[10212].斑马鱼是进一步研究hand 2在心脏发育中功能理想模型,作者克隆了斑马鱼hand 2基因,成功实现原核表达并制备效价较高、特异性较好的Hand2多克隆抗体,对进一步研究利用斑马鱼研究hand 2基因生物学功能奠定基础.1　实验部分1.1　实验材料大肠杆菌E .coli DH5a,E .coli BL21菌株,由本实验室保种;载体pGEX 24T 21为本实验室提供;限制性内切酶B am H I 和Sa l I,Tag DNA 聚合酶,10×l oading buffer 购买自深圳晶美公司;p MD182T 载体和连接酶购自大连TaKaRa 公司;柱式DNA 胶回收试剂盒(离心柱型)购买自博大泰克公司;蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、I PTG (异丙基2β2D 2硫代半乳糖苷)、RNase 等购自上海sangon 公司;弗氏佐剂购自Sig ma 公司;Glutathi one Sephar ose T M4B 购自Amersha m B i otech 公司;新西兰大白兔购自中南大学湘雅附一医院.1.2　斑马鱼hand 2基因生物信息学分析应用UCSC 程序(htt p://genome .ucsc .edu ),根据已克隆的人的hand 2基因序列,在NCB I 数据库(ht 2t p://www .ncbi .nl m .nih .gov /)中查找斑马鱼hand 2基因,分析该基因在染色体中的位置、外显子与内含子数目、基因全长和开发阅读框的碱基数目,及其编码蛋白质的氨基酸数目.S MART (htt p://s mart .e mbl 2heidel 2berg .de )分析蛋白质Hand2的结构域.Matchcode 软件用于核苷酸序列和蛋白质序列的匹配.DNA star 软件用于DNA 序列、蛋白质性质及进化关系分析.Pri m er Pre m ier 5.0软件用于酶切位点的分析和PCR 引物设计.凝胶分析系统用于分析蛋白相对含量.1.3　斑马鱼hand 2基因的分离及序列测定用热酚法[13214]抽提斑马鱼成鱼组织总RNA 1mg,按试剂盒说明书分离纯化出mRNA ,并以之为模板进行反转录PCR 扩增(c DNA PCR Kits,TaKaRa 公司),从而构建斑马鱼成鱼组织c DNA 文库.以提取的斑马鱼mRNA 反转录所得的c DNA 文库为模板,用根据以上分析得到斑马鱼hand 2基因序列设计合成的引物:5′端引物(5′GG AT CCATG AGTTT AGTTGG AGGGT 3′,含B am H I 酶切位点)和3′端引物(5′GT CG ACCT CATTGCT 2TCAGTT CCA 3′,含Sal I 酶切位点),进行PCR 扩增.PCR 反应条件如下:95℃变性5m in;95℃30s,58℃30s,72℃42s,反应32个循环;72℃8m in .所得PCR 产物纯化后与p MD182T 载体16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒,通过B am H I 和S al I 酶切鉴定后,在上海英峻公司测序分析.1.4　斑马鱼Hand2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备利用限制性内切酶B am H I 和S al I 双酶切pMD182T 2hand 2质粒,切取hand 2基因片段,与同以B am H I和S al I 双酶切的pGEX 24T 21质粒相连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,接种于LB 固体培养基平板上(含50mg/L 氨苄青霉素)筛选阳性克隆,提质粒,经B am H I 和Sal I 双酶切鉴定,进行测序分析.将鉴定正确连接的pGEX 24T 212hand 2质粒转入BL21菌株.将含重组子pGEX 24T 212hand 2的BL21菌株在LB 培养液中37℃培养过夜,以1∶50比例接种于200mL LB 培养液,37℃振荡培养至OD600至0.6,加入I PTG 至终浓度为0.5mmol/L,于30℃继续培养5h .收集诱导培养细菌,重悬于pH 8.0的P BS 溶液中,超声破菌,离心后取上清经S DS 2P AGE 电泳鉴定.经考马斯亮蓝R250染色,脱色后,用凝胶图象分析系统分析,计算蛋白质相对含量.将表达的蛋白超声裂解后,离心取上清.再将上清与Glutathi one Sephar ose T M 4B 结合30m in,3000r/m in 、4℃离心5m in,去上清.P BS 漂洗后,用还原型谷胱甘肽缓冲液缓慢混匀,重悬珠子15m in,3000901第1期 朱　婷等:斑马鱼hand 2基因的克隆、抗体制备及分析 r/m in 、4℃离心5m in 离心,上清即纯化的GST 2Hand2融合蛋白.免疫新西兰大白兔获取多克隆抗体将纯化得到的GST 2Hand2目的蛋白0.6mg 按体积比1∶1与弗氏完全佐剂混合,皮下多点注射免疫新西兰大白兔,在第14d 、第21d 再将目的蛋白0.15mg 与弗氏不完全佐剂混合并免疫.第28d 主动脉取血后,收集血清,即得到斑马鱼Hand2蛋白的多克隆抗体,分装后,-80℃保存.1.5　W estern blotti n g 分析抗体特异性将含pGEX 24T 212hand 2重组子的BL21菌株和含pGEX 24T 21的BL21菌株在LB 培养液中扩大培养,用I PTG 诱导后,收集细菌,P BS 重悬,S DS 2P AGE 电泳分离.将Hand2抗体稀释1000倍后,采用W estern bl otting 方法对表达的总蛋白抗原杂交,以检测抗体的特异性.同等条件下,用GST 抗体进行W estern bl otting 分析作为对照.1.6　免疫组化分析抗体特异性取斑马鱼成鱼心脏组织石蜡切片,脱蜡,3%H 2O 2室温孵育5～10m in;95℃的枸橼酸钠缓冲液(pH 610)中抗原热修复15m in;5%正常山羊血清封闭20m in 后,将Hand2抗体稀释100倍,于4℃孵育过夜;滴加生物素化羊抗免I gG,37℃孵育30m in;加S ABC 链霉亲和素2生物素2酶(或者F I T C )复合物室温孵育30m in,DAB 显色;苏木素轻度复染,中性树脂封片,各步骤间均用pH 7.4的P BS 漂洗2～3次,每次5m in .在相同条件下,以未免疫血清进行免疫组化分析作为对照.2　结果图1　hand 2的c DNA 序列、ORF 和编码蛋白2.1　斑马鱼hand 2基因克隆斑马鱼hand 2位于一号染色体上,全基因在基因组上长达2061bp,含两个外显子,一个内含子.其m RNA 为1668bp,该转录本编码一个长为208个氨基酸的蛋白质(图1),蛋白相对分子质量为23000.从491bp 到1117bp 为开放阅读框,其编码的蛋白包含一个HLH 结构域.利用斑马鱼hand 2基因序列在NCB I011 湖南师范大学自然科学学报 第33卷数据库中进行Homol ogene 搜索,发现在人类、小鼠、大鼠、猩猩、狗、原鸡、果蝇中都存在斑马鱼hand 2的同源基因.Hand2同源蛋白进化树分析表明:Hand2蛋白在人类、猩猩、小鼠、大鼠中的同源度高达82%;在狗中的蛋白同源度达60%,与果蝇的蛋白同源度为39%.经PCR 技术扩增出hand 2基因全长,将目的片段纯化回收后,与pMD182T 连接.用B am H I 和S al I 双酶切pMD182T 2hand 2质粒,产生与hand 2基因大小一致的酶切片段,约640bp (图2).表明hand 2基因已插入到pMD182T 载体中.测序结果与NCB I 数据库报道一致.2.2　重组表达质粒的构建及GST 2Hand2融合蛋白诱导表达和纯化将从p MD182T 2hand 2质粒切取下来的斑马鱼hand 2基因片段插入到pGEX 24T 21载体中,构建成pGEX 24T 212hand 2质粒,质粒以B am H I 和Sal I 酶切产生与hand 2基因大小一致的酶切片段(图3),表明斑马鱼hand 2基因已插入到载体pGEX 24T 21. M:S M0241DNA 分子量标准; M:S M0331DNA 分子量标准; 1:B am H Ⅰ/Sal I 双酶切结果. 1:B am H Ⅰ/Sal I 双酶切结果.图2　p MD182T 2hand 2质粒酶切鉴定图谱 图3　pGEX 24T 212hand 2重组表达质粒双酶切鉴定图谱收集诱导的细菌,P BS 重悬后超声破菌,取上清经S DS 2P AGE 电泳鉴定.结果表明,经I PTG 诱导后大量表达出相对分子质量约为49000的融合蛋白(图4),与预期结果一致.因为pGEX4T 21载体能表达出26000大小的GST 蛋白,而Hand2的蛋白相对分子质量为23000,故表达出的蛋白为49000大小的GST 2Hand2融合蛋白.该蛋白经Glutathi one Sephar ose T M 4B 亲和纯化后,S DS 2P AGE 电泳,经考马斯亮蓝染后,显示出特异性较强的条带,经凝胶图像分析系统分析,蛋白质相对含量高达71%,且为可溶性蛋白(图4). M:S M0671蛋白分子量标准;1:未经诱导的pGEX4T 21质粒转化的BL21总蛋白;2:I PTG 诱导后的pGEX4T 21质粒转化的BL21总蛋白;3:未经诱导的pGEX4T 212hand 2重组质粒转化的BL21总蛋白;4:I PTG 诱导后的pGEX4T 212hand 2重组质粒转化的BL21总蛋白;5:纯化的pGEX4T 212hand 2表达蛋白.图4　S DS 2P AGE 电泳图谱2.3　Hand2多克隆抗体特异性检测利用制备的Hand2多克隆抗体对含有重组子pGEX 24T 212hand 2和含有空载体pGEX 24T 21两种BL21菌株的I PTG 诱导表达蛋白进行W estern bl otting 分析,在相同条件下,以GST 抗体进行W estern bl otting 分析作为对照.结果表明:在用Hand2抗体进行分析时,在pGEX 24T 212hand 2诱导表达的GST 2Hand2融合蛋白的111第1期 朱　婷等:斑马鱼hand 2基因的克隆、抗体制备及分析 49000处能检测到特异性条带,而pGEX 24T 21诱导表达蛋白则没有49000特异性条带出现;而用GST 抗体分析时,则在pGEX 24T 212hand 2诱导表达的GST 2Hand2融合蛋白的49000处和pGEX 24T 21诱导表达的GST 蛋白的23000处均有条带出现(图5).说明利用GST 2Hand2融合蛋白制备的Hand2多克隆抗体对Hand2蛋白有抗性,对GST 没有抗性,制备的Hand2抗体特异性较强,达到了用于进一步实验的需要. A:用制备的Hand2多克隆抗体W estern bl otting 分析I PTG 诱导的pGEX 24T 212hand 2和pGEX 24T 21在大肠杆菌BL21中的表达蛋白;B:用GST 抗体W estern bl otting 分析I PTG 诱导的pGEX 24T 212hand 2和pGEX 24T 21在大肠杆菌BL21中的表达蛋白.图5　W estern bl otting 检测抗体的特异性2.4　免疫组化结果分析应用免疫组化SuperPicTure T M法(DAB 棕色反应法)染色的切片,背景无色或浅棕色.Hand2免疫反应阳性物质呈深浅不等的棕色和棕黄色颗粒,主要定位于细胞核内,细颗粒状(图6A ).而在对照组中,细胞的细胞核被苏木素复染成淡蓝紫色(图6B ),未出现棕色颗粒阳性信号,与预想结果一致.再次说明Hand2抗体是特异性的. A:用Hand2抗体免疫组化分析斑马鱼心脏组织,图中黄色颗粒即为阳性信号;B:用未免疫血清免疫组化分析斑马鱼心脏组织.放大倍数=230.图6　免疫组化分析抗体特异性3　讨论Hand2蛋白含一个HLH 结构域,属于bHLH 家族.在这个家族成员中,组成HLH 结构域的多数氨基酸相对保守,不同物种间Hand2蛋白的同源性大多可达到80%.与其他物种相比,斑马鱼hand 2基因的开放阅读框不长,仅627bp,通过PCR 技术作者很容易扩增出了斑马鱼hand 2基因,并将其插入到pGEX 24T 21表达载体上.pGEX 表达载体是谷胱甘肽转移酶(GST )表达载体系列,该表达载体是专为外源多肽能在大肠杆菌中表达,并可在非变性的条件下快速纯化而设计的.与其他表达载体不同之处在于,pGEX 表达载体S D 序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因,而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连.表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体,可用Glutathi one Sephar ose T M 4B 纯化出来.目的蛋白与GST 蛋白以融合蛋白形式在大肠杆菌BL21中表达是目前使用很广泛的表达系统之一,它不仅表达量高,而且具有纯化方便的优点[15].在进行融合蛋白诱导时,蛋白极易以包涵体的形式表达,而包涵体形成后的缺点是需变性、复性等复杂处理过程后才能得到可溶性融合蛋白质.为了避免变性、复性等复杂过程,通过改变诱导的温度、时间和I PTG 的浓度,摸索到最适宜的条件,即在诱导温度为30℃,I PTG 浓度为0.5mmol/L 的条件下诱导5h,使211 湖南师范大学自然科学学报 第33卷融合蛋白在上清表达,且不影响蛋白的大量表达,这样使得利用Glutathi one Sephar ose T M 4B 进行融合蛋白的纯化过程变得简单.在进行免疫组化实验时,热修复用的枸橼酸钠溶液的pH 值非常重要,偏高或偏低都将导致热修复效果不佳而影响免疫组化实验结果,故要严格控制好枸橼酸钠溶液的pH 值.本实验中,作者克隆了斑马鱼hand 2基因的全长,获得了高纯度的蛋白,并首次制备了斑马鱼Hand2抗体的多克隆抗体.W estern bl otting 及免疫组化等方法证明,制备的Hand2多克隆抗体能与原核生物和真核生物体内表达的Hand2蛋白结合,显示了该抗体与Hand2蛋白结合的特异性.因此,它为将来运用免疫共沉淀、染色质免疫沉淀、胚胎抗体染色等手段深入研究hand 2基因的功能奠定了基础.参考文献:[1]　OLS ON E,K LE I N W.bHLH fact ors in muscle devel opment:dead lines and comm it m ent,what t o leave in and what t o leave out[J ].Genes Dev,1994,8:126.[2]　SH I V DAS AN I R,MAYER E,ORKI N S .Absence of bl ood f or mati on in m ice lacking the T cell leukae m ia oncop r otein tal 21/SC L [J ].Nature,1995,373:4322434.[3]　JAN L,JAN Y .HLH p r oteins,fly neur ogenesis,and vertebrate myogenesis[J ].Cell,1993,75:8272830.[4]　E VANS S .Vertebrate Tin man homol ogues and cardiac differentiati on [J ].Cell B i ol,1999,10(1):73283.[5]　B I B E N C,HARVEY R.Homeodomain fact or Nkx225contr ols left/right asy mmetric exp ressi on of bHLH gene eHand during mu 2rine heart devel opment[J ].Genes Dev,1997,11:1357–1369.[6]　MOR I N S,CHARRON F,ROB I T A I L LE L ,et al .G AT A2dependent recruit m ent of M EF1p r oteins t o target p r omoters[J ].E MBO J,2000,19(9):204622055.[7]　Y AMAGI SH I H,OLS ON E,SR I V AST AVA D.The basic helix 2l oophelix transcri p ti on fact or,dHAND,is required f or vasculardevel opment[J ].Clin I nvest,2000,105:2612270.[8]　MARTHE J,MATT H I A S S,C AROL I N C,et al .The transcri p ti on fact or dHAND is a downstrea m effect or of BMPs in sy mpa 2thetic neur on s pecificati on[J ].Devel opment,2000,127:407324081.[9]　DAV I D G,MCF ADDE N,JEROE N C,et al .A G AT A 2dependent right ventricular enhancer contr ols dHAND transcri p ti on in thedevel op ing heart[J ].Devel opment,2000,127:533125341.[10]　CHUNG M ,LU J,W E NG Y,et al .Absence of mutati ons in hu man ubiquitin fusi on degradati on p r otein gene in tetral ogy ofFall ot[J ].J MolM ed,2001,79(526):3382342.[11]　T HOMAS T,K UR I HARA H,Y AMAGI S H I H.A signaling cascade involving endot helin21,dHAND and m sx1regulates de 2vel opment of neural crest derived branchial arch mesenchy me[J ].Dev,1998,125(16):300523014.[12]　P I O T R,AHN D,S CH I L L I N G T .The zebrafish vangogh mutati on disrup ts tbx1,which is involved in the D i2George deleti onsyndr ome in hu mans [J ].Devel opment,2003,130(20):504325052.[13]　李永青,曾伟奇,朱传炳,等.一个人类新基因Z NF322的研究初报[J ].生命科学研究,2001,5(2):1412145.[14]　王雁云,罗开梅,李永青,等.一种快速的胚胎组织总RNA 的提取方法[J ].生命科学研究,2001,5(1):88290.[15]　Y UAN C,RE ULAND J,LEE L,et al .Op ti m ized exp ressi on and ref olding of hu man kerat o ep ithelin in BL21(DE3)[J ].Pr o 2tein Exp r Purif,2004,35:39245.(编辑　王　健)311第1期 朱　婷等:斑马鱼hand 2基因的克隆、抗体制备及分析 。