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Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。
以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。
一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。
首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。
在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。
二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。
2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。
3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。
4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。
6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。
7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。
8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。
9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。
10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。
三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。
可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。
3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。
典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。
ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。
2.试剂失效。
3.试剂过失效日期。
4.试剂开启时间过长，污染。
5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。
6.反应时间不足。
7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。
1.控制室温并确保试剂回至室温。
2.与我公司联系。
3.更换新批号的试剂盒。
4.试剂开启后尽快用完。
5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。
移液不宜过快，排放应完全。
吸头内壁要清洁，最好一次性使用。
6.准确计时。
7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。
9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。
11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。
10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。
如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。
曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。
11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。
3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。
洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。
12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。
洗涤次数不够及注水量不够。
14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。
15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。
中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。
ELISA实验做不好？我们为您汇总了常见的30个问题！ELISA（免疫酶联吸附实验）是免疫学基础实验之一，大部分生命科学领域的科研工作者对其都不陌生。
因为其特异性强，灵敏度高，可精确定量的特性，在基础科研和临床诊断中，ELISA技术都应用广泛，相信很多关注我们的小伙伴也都做过ELISA。
ELISA实验步骤少，流程短，购买的即用型试剂盒也都有指导性很强的操作说明书，单次实验3-6小时即可得到结果，实验小白也可以很快的上手。
但是，各位同学可不要轻视哦，ELISA和WB、IHC等基础免疫实验一样，都是易学难精，上手容易，但想要得到稳定的结果，还是要花一点心思的。
小编在这里汇总了一些做ELISA的客户咨询我们的问题，把其中有代表性的集中做成了FAQ，大家快看看这其中有没有困扰你ELISA实验的问题吧~Q: ELISA可以检测胞内蛋白么？A:可以的，大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白，支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。
如需检测胞内蛋白，首先需要确认待测指标是否在胞内表达，然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。
Q: ELISA可以测DNA的表观么？A:不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。
测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP 技术。
Q:夹心法ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？A:不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。
这也是双抗夹心法ELISA不适用与小分子抗原和半抗原等待测指标的原因。
Q:试剂盒里面有捕获抗体么？A:即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。
ELISA常见问题和处理问题可能原因解决方法1、无颜色试剂孵育的时间没有按说明书操作。
确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。
2、不同试剂盒或不同批号的试剂混用。
重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。
不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
3、漏加酶检查操作流程，注意不要漏加5、HRP酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠标准品有问题(若在标本孔中有信号)按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂.漏加显色剂A或B加显色剂后观察一下液面高度试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。
缓冲液污染配制新新鲜的缓冲液显色弱超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。
检查产品的有效期加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。
试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右缩短孵育时间能使实验的信号变弱。
检查孵育的时间。
在温度变化的环境内孵育酶标板。
确定孵育的温度，应避免温度的变化。
使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。
标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。
低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。
样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。
检测时间不当是否在规定的时间内检测。
仪器设定不正确，滤光片不匹配。
仪器是否设定正确，滤光片的使用等。
高背景(本底)洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。
最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。
每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。
若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。
板的内侧不应接触设备。
检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。
ELISA中常见问题及解决方法：ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。
我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法1 选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
2 加样可能原因：1)血清或血浆标本分离不好即进行加样；2)手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；3)加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
解决办法：1) 标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
2) 加样后及时放入孵箱。
3) 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4) 如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
5) 标本较多时，请分批操作。
3 孵育可能原因：1) 孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2) 孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。
解决办法：1) 贴封片或加盖；2) 按说明步骤严格控制操作时间。
4 洗板可能原因：1) 采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2) 采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。
3) 反应板过多造成洗板等待时间长。
解决办法：1) 保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干；2) 合理安排，或多用几台洗板机。
ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。
2.试剂失效。
3.试剂过失效日期。
4.试剂开启时间过长，污染。
5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。
6.反应时间不足。
7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。
1.控制室温并确保试剂回至室温。
2.与我公司联系。
3.更换新批号的试剂盒。
4.试剂开启后尽快用完。
5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。
移液不宜过快，排放应完全。
吸头内壁要清洁，最好一次性使用。
6.准确计时。
7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。
9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。
11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。
10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。
如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。
曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。
11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。
3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。
洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。
12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。
洗涤次数不够及注水量不够。
14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。
15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。
中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。
（完整版）Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作⽅法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是⼀种实验室常⽤的检测⽅法，⼴泛应⽤于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测⽅法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相⽀持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和⾮特异性相互作⽤的分离，并可通过最终有⾊产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、⾎清、⾎浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作⽤的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测⽅法。
该实验可迅速分析⼤量平⾏样品，在基础研究和临床诊断实践中⼴泛使⽤。
⼀、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进⾏孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要⽤于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；⽆需使⽤⼆抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的⼀抗需要直接⽤酶标记，成本相对较⾼。
⼆、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加⼊特异性⼀抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标⼆抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标⼆抗结合，从⽽间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显⾊。
优点：酶标⼆抗可加强信号，提⾼灵敏度；灵活性更⼤，同⼀酶标⼆抗可应⽤于多种不同的⼀抗；不直标⼀抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使⽤标记抗体更少。
缺点：交叉反应⼏率升⾼。
三、双抗夹⼼法ELISA原理：双抗体夹⼼法适⽤于测定⼆价或⼆价以上的⼤分⼦，但不适⽤于⼩分⼦抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
ELISA实验中常见问题和注意事项临床标本的收集和保存用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。
本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面：1）要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。
当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。
2）标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。
3）血清标本可在2～8℃下保存1周。
如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。
冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。
此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。
ELISA测定中试剂准备在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。
如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。
因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。
其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
加血清样本及反应试剂血清样本使用微量加样枪加样。
使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点：1）加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。
2）加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。
尽量避免出现气泡。
3）反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。
滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间。
温育的时间与温度温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。
温育温度应在37℃，水浴。
温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。
温育实际测定操作中要注意以下几点：1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。
ELISA实验中常见的问题及解决方法如下：
加样误差：包括加样本及试剂量不准、孔间不一致。
解决方法包括校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密；重复某一样品时，加样时间尽可能与上次接近；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。
温育时间或洗板不一致：导致显色底物孵育效果不佳。
解决方法包括检查时间是否一致；校正温育箱温度。
试剂问题：包括显色液变质或者试剂过期、试剂稀释有误，如加酶的浓度过高、蒸馏水受酶等污染。
解决方法包括检查试剂盒有效期；请按说明书所示稀释倍数配制；使用新鲜蒸馏水。
洗板问题：如果没有洗板机，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。
封板膜使用不当：在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体时，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。
每次使用后要更换新的封板膜。
未及时读数：加完终止液后，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。
以上内容仅供参考，如果无法解决你的问题，建议咨询专业人士获取帮助。
ELISA常见问题及处理方法一、概述ELISA试验以灵敏度较高,特异性较好的特点在临床上、兽药残留检测得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致实验失败。
二、样本的处理步骤：采样与样品的制备（样品预处理）提取净化浓缩检测三、样品制备（1）样本采集来后应应注意：1.遵循代表性原则2.除去不可食部分3.防止处理样本时被污染3.如需制成同一样本，应将其混匀后再分次匀将4.匀将后分袋分装(一般用2号自封袋,每袋约30g)5.样品储存在–20℃6.不使用有异味或坏了的样本.四、药物提取用溶剂将待测样品中兽药溶解、分离出来的操作步骤。
根据样本和待测兽药种类，用不同溶剂和方法进行提取。
✶原理：相似相溶。
选择与待测兽药极性相似的溶剂，提取剂沸点应45～80℃，且不能与样本发生作用，毒性低，价格便宜，必须能溶解待测兽药。
对含水量高的样本，一般选与水相混溶的溶剂（乙腈、丙酮等），要求溶剂对样本有较强的渗透能力，以便能将样本中兽药充分提取。
当单一溶剂效果不理想，可选择2种或2种以上不同极性的溶剂，以不同比例配成混合提取剂。
四、提取方法✶①振荡法：将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使容器内的样品与提取溶剂充分接触，以深入到样本组织内部提取待测组分✶振荡方式：✶振荡器上进行上下、往返式振荡。
手摇式上下振荡✶注：1、在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
②均质法：用均质机对加提取剂的样本快速均质。
特点是快速、简便。
③超声法：样本加入提取剂，以超声波提取。
④索氏提取：提取效果好，但时间长，干扰物多。
多用于动物样本。
⑤快速混匀法：适用于液体样品。
五、净化将样本中待测兽药与干扰杂质分离的步骤。
原则是尽量完全除掉干扰杂质，而又使待测兽药损失尽量少。
但经过提取的待测组分，提取物中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质，这就导致我们在检测过程中出现假阳性。
2.将反应板放入恒温箱时，反应板不能叠放，以保证反应板受热均匀，温度能迅速达到平衡。
四、洗板
1.要按照试剂说明书上的说明配制好洗涤液，配制洗涤液用水最好为新鲜的蒸馏水，配制倍数准确。
2.洗板时要按照试剂说明书上的洗涤方法洗涤，不能随意改变洗涤方法，洗涤时间，洗涤次数。
3.不同厂家，不同批次试剂的洗涤液不能混用。
4.配制洗涤液用水的质量很重要，关系试验成败，准确与否，洗涤用水最好用新鲜合格的蒸馏水。
五、OD值测定
显色完成，加终止液后将反应板放入酶标仪检测OD值。
1.在反应结束前应将酶标仪开启，预热10～20 min，仪器放置应
鸡新城疫（New Castle disease）又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由副黏病毒科的新城疫病毒引起的急性高度接触性传染病，传播迅速，对鸡养殖业造成严重危害和巨大的经济损失。
对该病的防治目前没有特别有效的手段，主要通过接种疫苗来进行预防。
最近的研究表明，新城疫的流行表现出一些新的趋势，即在目前普遍采用疫苗免疫的情况下，。
