鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定

鸡大肠杆菌重组1型菌毛粘附特性及fimH基因克隆的开题报告题目：鸡大肠杆菌重组1型菌毛粘附特性及fimH基因克隆的研究一、研究背景及意义：鸡大肠杆菌是一种引起家禽肠道疾病的常见病原体，能引起鸡、鸭、鹅等家禽出现腹泻、高烧等症状，严重影响家禽养殖业的发展。

目前，针对鸡大肠杆菌疾病的防治方法主要是利用抗生素，但长期的抗生素使用容易导致细菌产生耐药性，同时也会带来环境和食品安全上的问题。

因此，寻找安全、高效的鸡大肠杆菌防治方法势在必行。

大肠杆菌的菌毛（fim）是细菌细胞表面的一种附着结构，在细菌的致病性和定植性方面起着重要作用。

菌毛通过与宿主细胞表面上的受体相互作用，进而粘附在宿主细胞表面上，从而定植和感染宿主细胞。

因此，菌毛可以作为研究鸡大肠杆菌粘附机制的重要研究对象。

二、研究内容：1. 利用分子生物学技术构建鸡大肠杆菌fimA、fimF、fimG、fimH、fimI五个亚基的表达载体，在大肠杆菌中表达这些亚基，获取重组1型菌毛。

2. 通过比较重组1型菌毛和野生型菌毛的差异，探究鸡大肠杆菌重组1型菌毛的粘附特性。

3. 利用PCR技术克隆fimH基因，并进行表达和纯化。

4. 探究fimH基因在鸡大肠杆菌菌毛形成和定植中的作用机制，为研究鸡大肠杆菌粘附机制提供重要参考。

三、研究方法：1. 分子克隆：利用PCR技术从鸡大肠杆菌中扩增fimA、fimF、fimG、fimH、fimI五个亚基基因，并将其克隆到表达载体中。

2. 细菌转化：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌中，通过培养和诱导获得重组1型菌毛。

3. 菌毛粘附特性研究：通过测定重组和野生型鸡大肠杆菌的粘附能力和侵袭能力，探究重组1型菌毛的粘附特性。

4. 质粒构建：利用PCR技术扩增fimH基因，将其克隆至表达载体中。

5. 表达和纯化：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌中，通过诱导表达fimH蛋白，并在蛋白质纯化过程中纯化fimH蛋白。

四、研究预期成果：1. 成功构建鸡大肠杆菌重组1型菌毛表达载体，并表达了重组1型菌毛。

鸡大肠杆菌ESBLs基因的克隆及序列分析张晓凤;张春辉;于顺周【摘要】To purified the isolated E. Coli in chickens from different area in Henan, screen phenotype for ESBLs according to NCCLS standards and the double-disc synergy method. Then according to sequences published in GenBank, designed two pairs of primers. The bacteria producing ESBLs were chose, extracted the total DNA, amplified with PCR, cloned, sequenced and analyzed. The results showed the three determinated sequences had 98. 9% to 99. 7 % nucleotide sequence homology with the two reference sequence, amino homology was 98. 1% to 99. 2%. And there were 15 nucleotide mutations and 6 mutations of amino in the 3 determinated sequences.%分离纯化来自河南不同地区的鸡大肠杆菌菌株,按照NCCLS标准和双纸片协同试验法进行ESBLs基因表型鉴定.然后根据GenBank已发表的序列设计两对引物,选择阳性表型菌株并提取总DNA,进行PCR、克隆、阳性质粒测序,将测定的序列拼接后和参考菌株ESBLs基因序列比较分析.结果显示,15株大肠杆菌菌株有3株菌株含有β-内酰胺酶,为阳性菌株,这3株与2个参考株核苷酸序列同源性为98.9％～99.7％,氨基酸序列同源性为98.1％～99.2％.3株大肠杆菌阳性菌株序列ESBLs基因型均为TEM型,核苷酸有15个位点发生突变,其中6个位点突变引起氨基酸变异.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)010【总页数】3页(P86-88)【关键词】ESBLs基因;克隆;序列分析【作者】张晓凤;张春辉;于顺周【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州450011;郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州450011;上海海利生物药品有限公司,上海201403【正文语种】中文【中图分类】S852.61鸡大肠杆菌病由大肠埃希菌致病性血清型引起，自1894年首次报道后，目前呈全球性分布，普遍存在感染及继发感染大肠杆菌病。

生物工程学报Chin J Biotech2008, September 25; 24(9): 1561-1567 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061cjb@© 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved致病性鸡大肠杆菌pilA基因和外膜蛋白C基因的克隆、表达及其免疫原性于珊, 张倩, 水小溪, 于宙亮, 赵宝华河北师范大学生命科学学院, 石家庄 050016摘要:根据GenBank公布的致病性鸡大肠杆菌的Ⅰ型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列, 分别设计了两对引物,并以分离的致病性鸡大肠杆菌基因组为模板, 经PCR特异性扩增出pilA基因和ompC基因, 基因产物大小为别为549 bp和1104 bp, 与GenBank报道的参考菌株的两个基因序列的同源性为高达98.18%和97.28%。

将扩增得到的两个基因分别定向克隆到原核表达载体pET-28a中, 得到两个重组质粒pET pilA和pET ompC, 转化大肠杆菌BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(pETpilA)和BL21(pETompC), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析分别可见表达的20 kD和40.9 kD的特异条带; Western blotting结果表明, 两种蛋白可与抗体发生特异性结合, 说明其具有良好的免疫原性。

将表达的菌毛蛋白和外膜蛋白的菌株分别制成基因工程疫苗, 免疫小鼠后, 具有很好的保护能力, 表明这两株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株。

关键词:鸡致病性大肠杆菌, Ⅰ型菌毛, 外膜蛋白, 克隆, 原核表达,免疫原性Cloning, Expression and Immunity of pilA Gene and ompC Gene from Avian Pathogenic Escherichia coliShan Yu, Qian Zhang, Xiaoxi Shui, Zhouliang Yu, and Baohua ZhaoCollege of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, ChinaAbstract: In order to amplify pilA gene and ompC gene of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strain, two pairs of primerswere designed according to the GenBank sequences, and a 549 bp pilA gene and a 1104 bp ompC gene were obtained by PCR separately. Sequence analysis indicated that the homology of the nucleotide sequence of AEPC strain to those other reference strainswas 98.18% of the pilA gene and 97.28% of the ompC gene. Two expression plasmids pET pilA and pET ompC were constructed byinserting pilA gene and ompC gene into the prokaryotic expression vector pET-28a. The two plasmids were transformated into E. coliBL21 separately and two recombinant strains BL21 (pET pilA) and BL21 (pET ompC) were obtained. The type 1 fimbraie and the out membrane protein were highly expressed when the recombinant strain BL21 (pET pilA) and BL21 (pET ompC) were induced by IPTG.Two specific proteins were detected by SDS-PAGE and immunogenicity of the expressed protein was confirmed by Western blottingand ELISA. The expressed fimbraie and OmpC were transformed into vaccine. The protective immune response was proved after themice were immunized with the two vaccines. The results showed that the recombinant strain BL21 (pET pilA) and BL21 (pET ompC)could be as candidate vaccine to provide protective immune response against AEPC infection.Received: February 23, 2008; Accepted: April 16, 2008Supported by: the Natrural Science Fund of Hebei Education Office (No. 2001240) and the Hebei Province Tackle Key Problems in Science andTechnology Funds (No. 012201130).Corresponding author: Baohua Zhao. Tel: + 86-311-86268434; Fax: + 86-311-86268313; E-mail：zhaobaohua86178@河北省教育厅自然科学基金项目(No. 2001240), 河北省科技攻关项目(No. 012201130)资助。

禽大肠杆菌I型菌毛鉴定方法的初步研究作者：许静王涛来源：《养殖与饲料》 2014年第6期许静1 王涛2*1.江苏省盱眙县动物卫生监督所，江苏盱眙211700；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300摘要禽大肠杆菌I型菌毛的表达和检测在禽大肠杆菌的发病机理和流行病学研究中至关重要。

本试验运用麦康凯琼脂平板从临床样品中分离鉴定了21 株禽大肠杆菌，对这些菌株进一步采用血凝/ 血凝抑制试验和PCR 2种方法检测其I 型菌毛。

检测结果显示：血凝/ 血凝抑制试验对待检菌株中I 型菌毛的检出率为85%（18/21），而运用PCR 方法的检出率为90%（19/21）。

表明运用PCR 方法检测I 型菌毛的检出率比MSHA 法更加敏感、快速，特异性强。

关键词大肠杆菌；I型菌毛；甘露糖敏感血凝试验；聚合酶链式反应；鉴定方法禽大肠杆菌I 型菌毛是禽源致病性大肠杆菌的相关毒力因子，在致病过程中介导细菌吸附于禽呼吸道黏膜上皮细胞，完成入侵的第一步，也是最重要的一步。

禽大肠杆菌病的发生与菌毛的粘附作用有很大关系。

一般认为，菌毛可粘附于鸡呼吸道的上皮，通过这种粘附，细菌得以定居，从而获得侵袭的通道[1-3]。

因此，禽大肠杆菌I 型菌毛的表达与检测，在禽大肠杆菌病的发病机理和流行病学研究中显得至关重要[4]。

1 材料与方法1.1 材料1）样品。

从盱眙县农贸市场健康家禽（其中鸡5只、鸭5只、鹅2 只）中无菌采集小肠肠道内容物，经麦康凯琼脂平板分离培养。

将经麦康凯琼脂平板分离到的大肠杆菌菌株分别命名为c1、c2、c3、c4、c5，d1、d2、d3、d4、d5，g1、g2。

其它大肠杆菌菌株（分别命名为1294，C600，C1214-77，O78F1+（5），A1，A2，A3，A4，B4）为扬州大学兽医学院微生物教研室提供，1294 为人工构建的表达I 型菌毛操纵子全基因DH5α 大肠杆菌，大肠杆菌C600、C1214-77、O78F1+（5）、A1、A2、A3、A4 及B4为表达I 型菌毛大肠杆菌致病菌株。

鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白氨基酸序列的变异戴鼎震;王晓丽;赵永前;甘黎明;冯秀丽;夏兴霞【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2004(020)003【摘要】1型菌毛是致病性鸡大肠杆菌重要的粘附因子。

鸡大肠杆菌通过1型菌毛对鸡呼吸道上皮的粘附，可获得侵袭上呼吸道，直达肺部入血的通道。

但1型菌毛也是一种理想的免疫原，可将l型菌毛制成菌毛亚单位疫苗，用其免疫鸡体，可使鸡体获得抗菌毛抗体，阻断鸡大肠杆菌1型菌毛对呼吸道的粘附，从而防止鸡大肠杆菌病的发生。

但由于【总页数】2页(P197-198)【作者】戴鼎震;王晓丽;赵永前;甘黎明;冯秀丽;夏兴霞【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院兽医研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院兽医研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院兽医研究所,江苏,南京,210014;南京农业大学动物医学院,江苏,南京,210095;江苏省农业科学院兽医研究所,江苏,南京,210014【正文语种】中文【中图分类】S858.31【相关文献】1.3个血清型鸡源大肠杆菌1型菌毛蛋白抗原位点变异分析 [J], 戴鼎震;王晓丽;侯继波;何家惠;戴建君;恽时锋;赵永前;汤厚宽;李鹏2.鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定 [J], 戴鼎震;崔生玲;蒋加进;陈钟鸣;张志成3.鸡大肠杆菌1型菌毛基因簇E基因的克隆与序列测定 [J], 薛茂云;蒋加进;陈钟鸣;崔生玲;张志成;高琴;戴鼎震4.Sabin1型脊髓灰质炎病毒在人二倍体细胞适应过程中5′端非编码区序列变异与滴度的关系 [J], 李华;胡凝珠;瞿素;刘国栋;谢忠平;姬秋彦;胡云章5.中国艾滋病病毒1型流行毒株V_3环序列变异性的研究 [J], 赵全壁;潘品良;温宁;邢辉;陈钊;魏民;邵一鸣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

致病性鸡大肠杆菌Ⅰ型菌毛 fimA 基因的克隆和同源性分析李成梅;胡业结;曾晓君;刘容珍【期刊名称】《仲恺农业工程学院学报》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】根据Genbank已发表的致病性鸡大肠杆菌（ Avian pathogenic Escherichia coli， APEC）Ⅰ型菌毛fimA基因序列，设计并合成了位于fimA基因保守区的1对引物。

应用PCR技术以鸡大肠杆菌标准株和分离株DNA为模板，扩增到片段长为549 bp的阳性产物；经酶切、连接、转化和筛选，得到fimA基因，并克隆、测序；运用DNAS－tar软件对核酸序列分析，确定所扩增和克隆的DNA片段为fimA基因。

【总页数】4页(P1-4)【作者】李成梅;胡业结;曾晓君;刘容珍【作者单位】仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州510225;仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州510225【正文语种】中文【中图分类】S858.32【相关文献】1.鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78I型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析 [J], 王忠山2.致病性鸡大肠杆菌type1菌毛fimC基因的克隆与序列测定 [J], 王亚君;樊琛;李一经3.鸡致病性大肠杆菌I型菌毛交叉保护性研究及其结构基因 FimA 的序列分析 [J], 隋兆峰;刘文强;范伟兴;许传田;赵宏坤4.鸡致病性大肠杆菌O1、O2和O78的Ⅰ型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析 [J], 王文成;张贵刚5.3株致病性鸡大肠杆菌P型菌毛结构基因的克隆、序列测定及同源性分析 [J], 苗玉和;王文成;张贵刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸡大肠杆菌FimH基因C端结构域克隆及特性分析白宇琛;谢金峰;周广防;冯秀丽【摘要】Objective]Through further study of Fim H ,the the main structure gene of avian Escherichia coli type I , the research aimed to provide necessary theoretical foundation for pathogenic mechanism of avian E .coli and develop-ment of gene engineering vaccinE.[Methods]Based on the published C terminal domain nucleotide sequence of Fim H gene for reference,this research designed and synthesized primers,amplified three strains of the relevant Fim H genes in avian E .coli including JS1,JS2 and JS6,used Lasergene software for sequence alignment and protein structure pre-diction,and the evolutionary tree was drew,etc.[Results]The results showed that the homology of gene nucleotide sequences between Reference strain and JS1,JS2 or JS6 were 97.3%,97.7% and 97.3%,and their amino acid se-quences was 95.3%,97.6% and 95.3%,respectively.Although their Fim H antigenic nucleotide sequences between Reference strain and JS1,JS2 or JS6 were 97.3%,97.7% and 97.3%,and their amino acid sequences was 95.3%, 97.6% and 95.3%,respectively.Although their Fim H antigenic determinants are basically similar,amino acids changes at 78 th and 79 th caused the different antigenic determinant at C terminal domain of Fim H ,which indicated that amino acid variation of Fim H sequences might have the minor effect on the antigenic property of Fim H .Further-more,the evolutionary tree analysis showed the close evolutionary relationship among three isolated strains and the do-mestic avian E .colistrains.[Conclusion]The results indicated that the Fim H gene of avianE .coli had no significant variation,which makes important foundation for further research on molecular mechanism of avian E .coli and the con-trol strategies against pathogenic avian E .coli.%[目的]通过进一步研究禽大肠杆菌I 型菌毛主要结构基因 FimH 的基因结构及其抗原特性，为深入探索鸡大肠杆菌致病机理及研制基因工程疫苗奠定必要的理论基础。