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《分子生物学试验》课程教学大纲课程编号： 05030适用专业：生物工程与生物技术试验学时数：36学时试验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学试验指导》徐庆华等成栋学院立项教材 2024一、课程说明《分子生物学试验》以介绍分子生物学中的试验方法、试验手段和培育学生试验操作技能为其主要内容。
须要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手实力，培育学生分析问题和解决问题的实力。
通过试验，要求学生能在原有的相关理论学问基础上较全面和深化理解分子生物学基本原理，驾驭基本的分子生物学试验方法和技巧，初步具备肯定的试验设计实力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
本试验课在方法上力求经典，试验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。
二、学时安排三、教学内容及教学基本要求试验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、试验特点试验类型：综合试验类别：专业基础安排学时：6 每组人数：2二、试验目的1、驾驭碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。
2、驾驭琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。
3、了解质粒DNA的粗略定量方法。
三、试验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培育基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后马上加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10 min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
实验一农杆菌感受态细胞的制备［目的及要求］了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
［实验仪器、材料和试剂］一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。
利福平（Rif）储液：50mg/ml20mM CaCl2，高压灭菌。
［实验步骤］1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；4、加入1000µl 20mM CaCl25、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500µl预冷的20mMCaCl，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃2保存备用。
分子生物学常用实验技术第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和cDNA合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组DNA的提取第七章 RFLP和RAPD技术第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：1009030302指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1. 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究一、本文概述本文旨在深入研究枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，以及质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
文章首先将对枯草芽孢杆菌的生物学特性进行简要介绍，包括其生理结构、生长环境及其在生物技术领域的重要地位。
随后，将详细阐述感受态细胞制备的原理和步骤，包括细胞的诱导、处理和保存等关键环节，并对不同方法进行比较分析，以找出最佳制备条件。
在此基础上，本文将深入探讨质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。
质粒转化作为一种高效的基因转移手段，对于枯草芽孢杆菌的遗传改造和功能研究具有重要意义。
文章将详细介绍质粒转化技术的操作流程，包括质粒的选择、转化条件的优化以及转化效率的评价等方面。
本文还将对枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法的应用前景进行展望。
随着生物技术的不断发展，这些方法在基因工程、生物制药、环境修复等领域的应用潜力将逐渐显现。
通过本文的研究，旨在为相关领域提供可靠的技术支持和实践指导。
二、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备制备枯草芽孢杆菌感受态细胞是质粒转化的关键步骤之一，它涉及到细胞的生长、处理和储存等多个环节。
以下是详细的制备过程：菌种复苏与活化：从低温保存的菌种库中取出枯草芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线接种，然后将其置于37℃恒温培养箱中倒置培养，待菌落长出后，挑选单个菌落进行活化。
种子液制备：将活化后的菌落接种到LB液体培养基中，以一定的转速（如200rpm）在37℃下振荡培养，直至达到对数生长期。
感受态细胞制备：将种子液按照一定比例接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4~6。
然后，将培养液转移到预冷的离心管中，冰浴10分钟，以4℃、4000rpm的条件离心10分钟，收集菌体。
细胞处理：去除上清液，用预冷的感受态细胞洗涤液轻轻悬浮菌体，冰浴10分钟，再次离心收集菌体。
重复此步骤一次，以彻底去除培养基中的盐分。
感受态细胞的制备过程— LB 液体培养基:胰蛋白胨, 1%(W/V ;酵母提取物, 0.5%(W/V ; NaCl ,1%(W/V ,用固体 NaOH 调节 pH 为 7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于室温。
摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制; — 0.1 mol/L CaCl2:称取 1.47 g CaCl2•2H 20(Amresco 分装溶于 100 mL去离子水中,灭菌后存于 4℃;—离心管(50 mL或 80 mL或 100 mL ,灭菌;—培养试管,灭菌;— 1 mL枪头,灭菌;— 1 mL加样枪;—滤纸,用牛皮纸包好后灭菌;— 10 mL量筒,灭菌;— 5 mL移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌;—冰,离心管架;—恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。
1.接种空白大肠杆菌于 3 mL LB培养基中, 37℃剧烈震荡培养过夜;2.将已培养好的种子液转入 100 mL LB培养基中扩大培养至 OD 650=0.3后,将培养好的细菌置于冰上冷却 10 min;3. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤纸上,将培养基控干;4.用 40 mL 冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。
冰上放置 30 min;5. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,再用 4 mL冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于 4℃放置 12~24 h以增加其敏感性后使用。
6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100 μL每管,再加入100 μL甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。
,于液氮或 -70℃冰箱中存放。
存于低温下的感受态细胞, 一定不能融解。
如果已经融解, 应丢弃, 而不能再冻结保存而继续使用。
注意事项:1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为 JM109。
感受态细胞的制备—LB液体培养基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl，1%（W/V），用固体NaOH调节pH为7.0~7.2，分装于三角瓶中，灭菌后存于室温。
摇动三角瓶，如果发现变浑浊，表明已染菌，应弃掉重新配制；—0.1 mol/L CaCl2：称取1.47 g CaCl2•2H20（Amresco分装）溶于100 mL去离子水中，灭菌后存于4℃；—离心管（50 mL或80 mL或100 mL），灭菌；—培养试管，灭菌；—1 mL枪头，灭菌；—1 mL加样枪；—滤纸，用牛皮纸包好后灭菌；—10 mL量筒，灭菌；—5 mL移液管，用棉花塞入管口，卷于报纸中灭菌；—冰，离心管架；—恒温摇床，可见分光光度计，玻璃比色杯。
1．接种空白大肠杆菌于3 mL LB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜；2．将已培养好的种子液转入100 mL LB培养基中扩大培养至OD650=0.3后，将培养好的细菌置于冰上冷却10 min；3．4℃，4 000 rpm离心10 min收集细菌，倒出上清，将离心管倒置于一干净滤纸上，将培养基控干；4．用40 mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，用加样枪冲吸，使菌体尽可能分散。
冰上放置30 min；5．4℃，4 000 rpm离心10 min收集细菌，倒出上清，再用4 mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，这些细菌可以立即使用，或者于4℃放置12~24 h以增加其敏感性后使用。
6．如果证明所制备的感受态细胞可用，可以在冰上分装为100 μL每管，再加入100 μL甘油（注意：甘油非常黏稠，吸取时应该多一点。
），于液氮或-70℃冰箱中存放。
存于低温下的感受态细胞，一定不能融解。
如果已经融解，应丢弃，而不能再冻结保存而继续使用。
注意事项：1．本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。
空白菌可以于平板上划线后，用Parafilm包好后存于4℃，也可将液体培养物存于4℃。
但如果要长期保存，则应将细菌保存于50%的甘油中，存于-20℃或-70℃。
当接种的细菌是来自于-20℃或-70℃存放的液体培养物时，接种应迅速，不等解冻，立即从表面刮下一块冰后，将菌种迅速放回低温存放；2．一般于3 mL LB培养基中过夜培养12 h后，菌体已很浓，可以进行扩大培养。
于100 mL培养基中培养2~3 h后，即可达到对数生长期。
但有时如果由于存放过久，或者已经过数次解冻，造成细菌生活力下降，则倍增时间会延长；3．对OD值的监测，当肉眼看到菌体已很浓时，于超净台上取3 mL测OD值。
开始可以每30分钟检测一次，越到后面检测的时间就应该缩短；4．感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。
因此，所有操作均应在超净台上。
也可以在实验台上进行，但应在后面放一酒精灯，所有操作都不能远离火焰。
最好每次恰好做感受态之前，将所有的枪头和管子都灭一下菌，用酒精棉球将加样枪的前端擦拭一遍；5．感受态细胞的细胞膜比较脆弱，因此一当用冰冷的CaCl2悬浮以后，即不能剧烈震荡或快速抽吸；6．根据我们的经验，纯度较高的含结晶水的CaCl2可以得到好的实验结果；7．所有的枪头和管子均应干净。
如果有可能，都尽量用新的。
如果是用的回收的枪头，一定要看管壁是否干净。
8．扩大培养用的液体培养基体积可以调整。
调整后的CaCl2溶液体积也按比例作相应的放大或缩小。
9．以本方法制备的感受态细胞的感受效率将随低温保存时间的延长而下降，所以最好是现做现用。
存于低温下的感受态细胞应该在一个月内使用。
而对于转化PCR连接产物，建议用其它的感受效率更高的制备方法。
本节后的附4介绍了一种高感受效率感受态细胞的制备方法。
质粒DNA的转化—LB液体培养基：见感受态细胞的制备；—LB固体培养基：于液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。
不用在灭菌前溶化琼脂粉，灭菌完后，轻轻摇匀。
注意不能剧烈摇动，否则可能会使培养基暴沸；—LB平板：将灭菌后的固体培养基冷至60℃左右时，倒入90 mm的培养皿中（约30 mL。
如果先前已加入了抗生素，则还应在超净台上晃动培养皿几次；—200 μL枪头，1.5 mL Ep管，灭菌；—42℃水浴；—10 μL，200 μL加样枪；—培养试管，灭菌；—恒温摇床，恒温培养箱；—菌液推棒；—抗生素储液，本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类，氨卞青霉素（Amp）（储液，100 mg/mL，溶于无菌水中，工作浓度100 μg/mL，即每毫升培养基取1 μL储液）；四环素（Tet）（储液，5 mg/mL，先用1/2体积的乙醇溶解，再加入1/2体积的无菌水，工作浓度50 μg/mL，即每毫升培养基取10 μL 储液。
储液全部于-20℃保存）；—冰；1．如果是冻存的感受态细胞，先于冰上溶解；2．加入用于转化的质粒DNA 1 μL；3．冰上放置30 min；4．于42℃热击60 s；5．迅速放于冰上，5 min后进行下一步；6．将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管，该培养试管有已预热至37℃的LB液体培养基，使总体积为1 mL，温和震荡（200 rpm左右）培养1 h；7，将复苏的培养物倒入一Ep管中，4℃，4 000 rpm离心10 min，将培养基倒掉，用残留的培养基悬浮，然后用加样枪将菌液加到LB平板上，用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30 min后，倒置培养过夜。
注意事项：1．热击时间要根据所用管子的传热效率，薄壁管子的传热效率高，热击时间可以缩短到45 s；2．热击时，要使水浴尽可能不要流动，热击后应迅速放回冰上；3．于37℃复苏细菌时，不能加抗生素，摇动也不能太过于剧烈；4．对照的设置对于评价转化结果非常重要，将10 μL感受态细胞分别涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上，如果感受态细胞没有问题，则应该在不含抗生素的平板上生长，而在含有抗生素的平板上不能生长。
5．一般转化细胞可以用其中的1/3涂布一个平板，2/3涂布一个平板。
不过，对于多拷贝质粒，也可以不用离心，取50 μL涂布一个平板足矣。
质粒DNA的提取—储液：100 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)：称取Tris 12.1 g, 用浓HCl调节pH 为8.0，然后定溶至100 mL，灭菌后存于4℃；100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：称取18.6 g二水乙二胺四乙酸二钠，加80 mL去离子水，加热溶解，用固体NaOH调节pH为8.0，然后定溶至100 mL，灭菌后存于4℃；100 mL 10% SDS，称取10 g十二烷基硫酸钠于80 mL去离子水中，加热溶解后存于室温；2 mol/L NaOH 10 mL，称取0.8 g固体NaOH溶解，定溶至10 mL，于塑料瓶中室温存放，可以不灭菌。
—溶液I：每配制100 mL，称取葡萄糖0.9 g (50 mmol/L)，1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2.5 mL (25 mmol/L), 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 2 mL (10 mmol/L)，定溶至100 mL，灭菌后存于4℃；—溶液II：现用现配，每100 μL需要2 mol/L NaOH 10 μL (0.2 mol/L)，10% SDS 10 μL (1%)，然后加80 μL无菌水；—溶液III：每100 mL 称取KAc 49.1g,于70 mL去离子水中溶解，然后加入冰乙酸11.5 mL，定溶至100 mL后，灭菌存于4℃；—TE (pH 8.0)：每100 mL取1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)储液1 mL (10 mmol/L)，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 0.2 mL (1 mmol/L)，定溶至100 mL后，灭菌存于4℃；—无DNase的RNaseA：将RNaseA溶于10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 15 mmol/L NaCl中，使终浓度为10 mg/mL,于100℃加热15分钟，缓慢冷至室温，然后存于-20℃；—Tris饱和酚(pH 8.0)；—氯仿/异戊醇（24：1）；—100%乙醇与70%乙醇，均于-20℃存放；—1.5 mL Ep管，200 μL及1 mL枪头，灭菌；—40 μL，200 μL，1 mL加样枪；—滤纸，1.5 mL Ep管；—冰；1．接种一单菌落于3 mL含相应抗生素的培养试管中，于37℃剧烈振荡培养过夜；2．将全部培养物分两次倒入1.5 mL Ep管中,12 000 g离心1 min收集细胞; 3．将Ep管倒置于一干净滤纸上，将培养基尽可能流尽；4．将细菌沉淀重悬于200 μl冰预冷的溶液I中，剧烈振荡使细菌沉淀分散；5．加400 μL新配制的溶液II，盖紧管口，轻柔的快速颠倒Ep管5～10次，然后将Ep管于冰上放置5 min；6．加300 μL用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将Ep管颠倒混合15次左右，然后将Ep管于冰上放置5 min；7．2℃，12 000 g离心5 min，将上清转入另一Ep管，加等体积的酚/氯仿，振荡混匀，2℃，12 000 g离心5 min；8．吸出上清，再加等体积的氯仿抽提；9．在吸出的上清中加入2倍体积冰冷的乙醇于室温沉淀2 min；10．2℃，12 000 g离心5 min，倒出上清，沉淀用70%乙醇洗两次。
然后倒置于一滤纸上，让乙醇挥发干净；11．高拷贝质粒溶于含5 μL RNaseA的50 μl TE中；低拷贝数质粒减半。
注意事项：1．细菌培养时间不宜过长，一般以12~16 h为宜，如果培养时间过长，培养物会非常粘稠，这会导致离心沉淀的困难；2．一般细菌培养好以后，应该马上提取。
如果不能马上提取，于4℃存放时间不能过长；2．加溶液I分散细菌沉淀比较关键，如果分散不好，将直接影响产率；3．溶液I加入后，溶液会非常浑浊，加入溶液II颠倒几次后，溶液变清，打开管口，会发现溶液呈鼻涕样，加入溶液III颠倒后，会发现有沉淀物形成，该沉淀物位于溶液上层。
如果发现沉淀不能自动聚集，而是呈烂棉花状，且离心后不能沉到管底，则预示着实验的失败；4．培养基的成分非常复杂，如果去除得不太干净，则有可能影响到后面的酶切效果；5．乙醇必须去除干净，否则会造成电泳点样时上漂；但样品又不能干燥太久，否则有可能使得质粒DNA沉淀难于溶解在TE中。
6．SDS在低温下会析出结晶，因此配制溶液II时应先于60℃溶解；7．如果一次要提多个样品，可以先一起配制溶液II，而后加入每管。
但配制时应略大于所需要的量；附：1．苯酚的平衡—重蒸苯酚—8-羟基喹啉—水浴锅—固体Tris—50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0): 称取6.055 g Tris，溶于800 mL蒸馏水中，用浓HCl调pH为8.0，定容到1 L。
