实验八 大分子物质

实验八 酵母RNA的提取——苯酚法 酵母RNA的提取——苯酚法 RNA的提取——
一、实验目的和要求 1、 了解核酸的组成及RNA提取技术。 2、 掌握用苯酚法制备RNA的原理和方法 二、实验基本原理 苯酚法适用于tRNA的提取。从细菌或酵母细胞中提取tRNA，可在不经细胞 破碎，直接用被水饱和的中性苯酚抽提，苯酚可以改变细胞壁的通透性，使 tRNA (分子量在25000左右)从细胞中释入出来，而大分子核酸仍留在细胞内。 通过离心，将含有酚水和细胞碎片的乳浊液分成两相， 上层水相为水溶性RNA、 多糖及小分子极性物质，下层酚相为被水饱和的酚、变性蛋白质和DNA（大多与 变性蛋白质缠连）菌体残渣等。在酚相和水相界面有一层凝集的变性蛋白质。 用乙醇沉淀水相中的大分子物质，tRNA即呈白色絮状沉淀析出，同时除去可溶 性的酯类等杂质。再离心，弃上清液，得到tRNA沉淀样品。苯酚法是提取具有 生物活性的，不降解RNA的简便而有效的方法。 酵母RNA的提取→乙醇沉淀 →得到粗品RNA
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图1. 苯酚提取液离心后分层的情况 1. 水层（RNA、多糖 多糖） 多糖 2. 中层（变性蛋白层 变性蛋白层） 变性蛋白层 3. 酚层（DNA及蛋白质 及蛋白质） 及蛋白质
2、有机溶剂（乙醇）纯化RNA： 有机溶剂（乙醇）纯化RNA： RNA 含有RNA溶液中加入2倍体积的95%乙醇，混匀，于冰浴中放置20 min， RNA结絮沉淀出来。5000rpm 离心5min。小心弃去上清液，用小玻棒将沉淀 小心转移到称量纸上，自然风干或烘干。RNA粗制品供定量实验用。
五、实验操作方法和步骤 1、酵母细胞破碎、提取RNA ： 酵母细胞破碎、提取RNA 称取干酵母粉1.0g , 入150 ml具塞锥形瓶中，加蒸馏水5ml , 再小心加 入90%苯酚5ml（苯酚有毒！并具腐蚀性），盖好锥形瓶的塞子，在摇床上振 摇反应 40 min后，把具塞锥形瓶中的内容物转入2支7ml离心管中,将2支离心 管平衡后，8000rpm离心10min。用吸管小心吸取上清液（含RNA)转移到另一 支干净离心管中。见图1。 图

1．培养基（每组的量，由班长分发）
• 灭菌培养皿（淀粉水解）：3皿
• 明胶液化培养基： 4支
• 葡萄糖发酵培养基： 3支
• 乳糖发酵培养基： 3支
• 淀粉培养基：
1瓶/2组
2.接种用具
接种环（针），酒精灯，标签纸，试管架
3.实验菌种
枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，普通变形杆菌，
金黄色葡萄球菌
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四、实验内容
（2）将接种过和作为对照的6支试管置于37℃恒温培养箱培养 24h。
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..实ຫໍສະໝຸດ 结果糖发酵实验.五、实验结果
（1）大分子物质水解实验结果
将结果填入下表。“＋” 表示阳性，“－”表示阴性 注意：观察结果时，可打开皿盖，滴加碘液于平板上，轻轻旋转， 使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，则说明 淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力 的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有 无透明圈）
实 验八
大分子物质的水解实验 及糖发酵实验
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一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力的 不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子水解实验的原理和方法 3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作
用 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法
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二、实验原理
微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得 微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开 发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类 鉴定工作中，常利用其生理生化反应作为重要依据。
的背面分别记下菌名。 （3）将接完种的平板倒置于37℃恒温培养箱，培养24h。 2. 明胶液化试验 （1）取4支明胶培养基试管，用接种针分别以穿刺接种法接种枯草

大肠杆菌为阳性 红色 ,产气肠杆菌为阴性 黄色 ,
伏－普试验用于测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产 物的能力,如丙酮酸,丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合 物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的 精氨酸的呱基作用,生成红色化合物,即伏－普试验阳性,不产生红色化 合物为反应阴性,
实验八 微生物生理生化试验
一 实验器材 1 菌种 大肠杆菌,普通变形杆菌,金黄色葡萄球菌,产气肠杆菌 2 培养基 尿素琼脂试管,蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,葡萄糖发酵管 和乳糖发酵管各3支, 3 溶液和试剂 甲基红指示剂,5％萘酚,乙醚和吲哚试剂 4 仪器和其他用品 接种针
二 目的要求 1 大分子物质水解试验
三 糖发酵试验 1 在发酵管上标明所接种的细菌名称, 2 取葡萄糖发酵管3支,分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌,第三支不接 种,作为对照,另取乳糖发酵管3支,同样操作, 3 将接种和对照的发酵管置37 ℃培养24－48h, 4 观察发酵管的颜色和有无气泡,
各试验需接种的菌种:
1 明胶水解试验：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 20 ℃ 2－5 d
3 尿素试验 1 取2支尿素培养基试管,用记号笔表面各管欲接种的菌名, 2 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌 两种细菌对尿素的分解速
度不同 ,需要观察2次, 3 将接种后的试管置35 ℃培养24－48h, 4 观察培养基颜色变化, 尿素酶存在时为红色,无尿素酶时为黄色,
二 IMViC试验
1 接种与培养 1 用接种针将大肠杆菌和产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中
温15－30 min,红色为阳性,大肠杆菌阴性,产气肠杆菌阳性
思考题
1. 为什么尿素实验可用于鉴定变性杆菌属 细菌

ຫໍສະໝຸດ 五、药品和试剂 酚（Tris饱和酚）、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠 (SDS)、Tris 碱、乙二胺四乙酸（EDTA）、异丙醇。 溶液配制： 消化缓冲液：含100mM的Nacl，10mM Tris.cl （PH8.0）, 25mM的EDTA（PH8.0）, 0.5％的SDS。 TE缓冲液（PH8.0）：含10mM Tris.cl（PH8.0）,1mM 的EDTA（PH8.0）。 电泳缓冲液TAE： 电泳缓冲液（50×TAE）：取Tris24.2g ，冰醋酸 5.7ml， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至 100ml。 1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 0.7％琼脂糖凝胶的配制：称取0.28g琼脂糖，加入40ml 1×TAE，于电炉上加热至沸腾，待凝胶冷却至50℃左 右（手试微烫），加入3μl GoldViewTW荧光染料，混 匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。




注意事项： A 实验前将部分药品（酚、氯仿、异戊 醇、异丙醇）4℃预冷。 B 消化液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进 DNA溶解 C 避免在操作过程中机械振动过于剧烈，以免 造成DNA的断裂。 D 使用离心机要注意安全，先定时，再将转速 从零慢慢增大。 E 乙醇洗涤DNA后一定要晾干，否则电泳点 样时样品容易上漂。

基因组DNA的提取图片
预备知识

核酸是重要的生物大分子之一，脱氧核糖 核酸（DNA）是核酸的一种，DNA是绝大 多数生物（除少数RNA病毒外）记录、存 储、传递遗传信息的分子。近年来，分子 生物学技术迅速发展，在分子遗传学研究 领域的诸多方面涉及到抽提基因组DNA的 方法。DNA的提取是进行PCR扩增、 Southern杂交、限制性片段长度多态性分析 等实验的基础。