分子诊断技术的临床应用ppt课件

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《分子诊断项目》PPT课件

淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；
探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）
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33
淋巴细胞亚群双色分析
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34
先天性无 r 球蛋白血症
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35
淋巴细胞亚群双色分析
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36
HLA-B27
☆ HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27阳性。其他，如Reiter s综和症阳性率70-90%，银屑病性关节炎阳性率50-60%，葡萄膜炎阳性率40-50%
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42
染色体模式图
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43
人类23对染色体
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44
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45
反应体系中，从而脱离3’端
荧光淬灭基团的屏蔽，发出
荧光，荧光信号与PCR产物
的数量成比例。因此根据
PCR反应液的荧光强度即可
计算出初始模板的数量。
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15
定量PCR在乙肝检测中意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播
指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对
未知模板进行定量分析。
Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：

分子诊断技术临床应用

分子诊断技术的临床应用
分子诊断技术临床应用
一、分子诊断的概念
狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术，是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组学、代谢物组学等新兴学科的发展，分子诊断的内涵已经从单纯的DNA/RNA拷贝、突变等变化的检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测，并广泛应用于疾病的筛查、诊断、治疗监测、预后与预防等生命科学的各个领域。
分子诊断技术临床应用
SAT 检测技术的优势：
检测靶标：RNA 灵敏度高，特异性强，易鉴别死菌、活菌，适合临床判愈; 扩增产物：RNA 高效扩增，低污染; 核酸提取：磁珠法提取纯度高结果准确; 检测方法：实时荧光检测，扩增、检测同时进行全程监控; 扩增方式：42℃恒温无需热循环，设备成本低。
不同的技术平台有各自的优缺点，我们要针对不同的实验标本对象及需
求,选择适合的技术方法，力求在“高效,高质量,低成本”这三者间找到合适
的平衡点。
分子诊断技术临床应用
总结
分子诊断学的快速发展，得益与分子诊断技术的日新月异。1990年启动的人类基因组计划的完成经历了十三年的时间，而2007启动的1000人基因组计划的完成却只用了3年，人类了解自然密码的速度正在跨上快速列车。检验医学以提供精密准确的数据服务于临床，而分子诊断技术正逐渐成为临床实验室的常规应用技术，这将为检验医学的发展提供巨大的机遇与挑战。
PCR＋临床诊断
PCR＋肿瘤研究
38%
分子诊断技术临床应用
二、PCR概述
（二）原理
双链DNA 变性
退火延伸

PCR分子诊断技术PPT课件

PCR临床意义：
快速确诊是否有病毒、细菌等致病性微生物感染；
了解体内感染的数量、复制程度，是否具有传染性；
对临床治疗的用药监测，有无好转或耐药情况，如产生耐药，如何指导用药种类及计量等。
PCR的发展趋势
随着临床分子生物学的不断发展，DNA测序技术已逐渐成熟，可为临床疾病的分子诊断提供更精确的判定依据，现由一代测序技术已发展至三代测序技术，为医疗领域带来更方便、快捷的检测手段。
1
脱氧核甘三磷酸（dNTP）标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三磷
酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。二价阳离子
所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常用的是Mg2＋，Mn2+ 缓冲液
维持PCR反应体系中的PH，使用Tris－Cl缓冲液。一价阳离子
4.仪器使用的注意事项：放置水平、有稳定的电压并连接地线（配备UPS不间断电源）、保证正常运行的室温温度不超过15-25，仪器要放置在通风、散热较好的区域，远离水源、火源、有腐蚀性物质及磁场感染等环境影响。
5.仪器的维护与保养：在日常实验结束，仪器冷却后对仪器表面进行正常维护及保养工作；使用中应小心热盖与反应槽的污染，并定期使用95%的乙醇进行擦拭，如被污染严重应先使用中性消毒液进行处理；每
PCR实验室质量管理体系的建立
依据国内《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和ISO15189认可： CNAS CL02《医学实验室质量和能力认可》的准则和美国CAP认证的PCR分子实验室要求等相关规定，建立标准、规范化的实验室质量管理体系内容。
体系结构质量手册：阐明实验室的质量方针、并描述质量体系的文件，包括实验室的质量方针、目标、组织结构及质量体系要求等。程序文件：对实验室工作流程的文件化描述，包括目的、范围、职责及具体工作流程等。

《分子诊断与临床》PPT课件

自动化测序---常规应用
精品医学
22
链末端终止法测序原理精品医学
化学降解法测序原理23
自动化测序
充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、
安全、精确、并行和高效等特点
目前，自动化测序已成为DNA序列分析的
主流，几乎完全取代了手工测序
类型：
➢ 基于单一荧光染料标记的自动化测序系统 ➢ 基于多种荧光染料标记的自动化测序系统
精品医学
40
中国生物信息数据库
中国国家生物医学数据库中国核酸序列数据库
➢ 中国核酸序列数据库 ➢ 中国人核酸序列统计数据库
精品医学
41
三、分子诊断在临床的应用
1. 单基因疾病的分子诊断 2. 多基因疾病的分子诊断 3. 肿瘤的分子诊断与预测 4. 感染性疾病的分子诊断 5. 在耐药性研究中的价值 6. 在个体化治疗中的应用 7. 分子诊断在临床的其他应用
➢ 随机测序法（鸟枪法、人工转座子法） ➢ 定向测序法（引物测序法、互套缺失法） ➢ 全基因组测序策略
精品医学
21
DNA测序常用技术
链末端终止法（ Sanger法）化学降解法测序新技术
➢ MALDI-TOF MS ➢ 杂交测序法 ➢ 焦磷酸测序技术 ➢ 原子探针显微镜法 ➢ 单分子测序技术
精品医学
42
1、单基因疾病的分子诊断
血红蛋白病的分子诊断肌营养不良症的分子诊断血友病的分子诊断
α1抗胰蛋白酶缺乏症的分子诊断
Leber`s遗传性视神经病变的分子诊断其他单基因疾病的分子诊断
精品医学
43
谷氨酸(GAN) HbA
缬氨酸(GUN) HbS
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析

分子生物学技术的临床应用PPT精品课程课件讲义

DNA
RNA
核酸的一般理化性质

多元酸，具较强的酸性。 DNA是线状高分子，粘度很大，碱性条件下稳定；RNA分子较小，粘度也小，对酸稳定。核酸分子在机械力的作用下易发生断裂。

碱基有共轭双键，具紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm。
可对核酸进行检测和定量，也可分析纯度。核酸变性 ——加热、极端的pH、有机溶剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。
核苷酸链（一级结构）
5末端 (游离磷酸基)
3'，5'–磷酸二酯键 3末端 (游离羟基)
DNA的双螺旋结构
特征：
①两条链以反向平行的方式围绕同一中心轴向右盘绕
②主链处于螺旋的外侧（核糖+磷酸）亲水核糖平面与螺旋轴平行
碱基处于螺旋的内侧，与中轴垂直
③螺距：10bp—3.4nm—3600 đ=2nm ④大沟与小沟：
蛋白质与蛋白质相互作用
酵母双杂交；蛋白质免疫共沉淀；
The Nobel Prize in Physiology or Medicine：

1978年 Arber等
限制性核酸内切酶的发现

2006年 Fire，Mello 2007年 Smith等
RNA干扰基因打靶
The Nobel Prize in Chemistry ：
基因病
病因学诊断
分子诊断-第四代实验室诊断技术
诊断指标的选择；诊断结果的判定；
限制性酶谱分析
分子生物学技术的临床应用
原位杂交技术－筛选21三体（间期）
13号染色体（绿）和21号染色体（红）探针与羊水间期细胞杂交，可见两个绿色信号和三个红色信号，说明是21三体。

《分子诊断技术》课件

2010年代至今
随着生物信息学和人工智能技术的发展，分子诊断技术不断优化和升级，应用领域也不断
拓展。
02
分子诊断技术的基本原理
核酸的提取与纯化
核酸提取
核酸提取与纯化的重要性
是指从生物样本中分离和纯化核酸的过程，是分子诊断技术中的基础步骤。
是确保后续分子诊断实验结果准确性和可靠性的关键。
案例三
总结词
SNP分型技术有助于个体化医疗的实现，为患者提供更加精准的治疗方案。
详细描述
SNP分型技术可以对个体的基因变异进行精细分析，预测个体对不同药物的反应和代谢情况，为医生制定个体化的治疗方案提供科
学依据，提高治疗效果并减少副作用。
THANKS
感谢观看
特点
高灵敏度、高特异性、早期诊断、个性化治疗指导等。
分子诊断技术的应用领域
遗传性疾病诊断
通过对基因突变进行检测，对遗传性疾病进行早期发现和干预。
肿瘤诊断与监测
通过对肿瘤相关基因和蛋白质的检测，对肿瘤进行早期发现、诊断、分期、预后评估和复发监测。
感染性疾病诊断
通过对病原体基因和蛋白质的检测，对感染性疾病进行快速诊断和用药指导。
01
02
03
个性化医疗
结合基因组学、蛋白质组学等技术，实现个体化、精准化的诊断和治疗。
无创检测
研究无创或微创的分子诊断技术，减少对患者的创伤和痛苦。
实时监测
实现实时、动态的分子诊断监测，及时发现病情变化，为治疗提供及时反馈。
05
案例分析
案例一：基因突变检测在肺癌诊断中的应用
总结词
基因突变检测在肺癌诊断中具有重要意义，有助于早期发现和个性化治疗。

分子诊断技术的应用进展-张健_PPT幻灯片

在血液肿瘤的诊断方面，FISH用于染色体异位的融合基因检测、基因缺失检测、微小残留病灶监测、骨髓移植监测等。
在感染性疾病检测方面，FISH检测痰液标本中铜绿假单饱菌、流感嗜血杆菌等常见菌的敏感性可以达到90％，特异性100％［9］。对于军团菌、幽门螺旋杆菌和结核杆菌等较难培养鉴定的细菌，FISH在快速诊断上也显示了很好的应用前景。
• RT-PCR：病原体的多重PCR（Multiplex PCR），提高敏感性和特异性的巢式PCR（nested PCR），研究基因表达的原位PCR （in situ PCR），分析RNA的逆转录PCR（RT-PCR）以及锚定 PCR、不对称PCR、膜结合PCR等等。
不同方式的PCR技术
名称简并引物扩增法
• 温度循环式的扩增技术，以常规（conventional PCR）和实时 PCR（real time PCR，RT-PCR）为主，
• 等温方式的扩增技术，以核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录介导的扩增（Transcription-mediated amplification，TMA），环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技术为主。
微流控芯片：是在几平方厘米的单晶硅片、石英、玻璃或有机聚合物等材料上刻制微通道，实现样本预处理、反应、分离和检测的微型检测平台，可快速高效、高通量的完成基因、蛋白及各种小分子分析和鉴定
芯片实验室：是在微流控芯片基础上发展了更为复杂的分析系统，将微机电技术于微流体技术相结合，将所需的反应均集中在一块芯片上，建立微型分析系统（Micro total analytical system，u-TAS）

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分子诊断技术的临床应用
6
二、PCR概述
PCR技术能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
分子诊断技术的临床应用
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PCR 发展简史
1983 Mullis于12月16日成功发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Mullis及其同事等人在
伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等
分子诊断技术的临床应用
13
常规结核病实验室诊断方法及不足
1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低、费时 2. 细胞培养“金标准”：周期太长(4-8W) 3. 血清学诊断：
a. 接种BCG可出现阳性 b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人 c. 交叉反应，假阳性不能早期诊断！容易漏诊、误诊！
• 高效扩增、忠实复制！
分子诊断技术的临床应用
12
三、荧光定量PCR技术的临床应用
一病原体检测
病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因检
测优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱
疹病毒（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒（RUB）其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、
分子诊断技术的临床应用
15
荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。
4. TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，
TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据
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三、荧光定量PCR技术的临床应用
四其它应用 1. 法医学鉴定 2. 抗病毒药物疗效的观察、指导 3. 缩短诊断的窗口期
分子诊断技术的临床应用
19
窗口期：
所谓“窗口期”,是指从感染病原体开始 ,直至用某种检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间。
30%
32%
PCR＋遗传分析
PCR＋临床诊断
PCR＋肿瘤研究
38%
分子诊断技术的临床应用
10
二、PCR概述
（二）原理
双链DNA 变性
退火
（膜板）（双链分成单链）（膜板与引物杂交）
延伸
（DNA合成）
不断重复
PCR循环次数与DNA产量关系
分子诊断技术的临床应用
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PCR反应的特点
• 高灵敏度 • 高特异性 • 简便快捷
《Science》杂志上发表 1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq
DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 10月13日 Mullis获诺贝尔化学奖
1995 荧光定量PCR技术出现
九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开
1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用
分子诊断技术的临床应用
分子诊断技术的临床应用
1
一、分子诊断的概念
狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术，是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组学、代谢物组学等新兴学科的发展，分子诊断的内涵已经从单纯的DNA/RNA拷贝、突变等变化的检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测，并广泛应用于疾病的筛查、诊断、治疗监测、预后与预防等生命科学的各个领域。
分子诊断技术的临床应用
3
二、基于测序技术为基础的分子诊断技术 DNA的序列分析是分子诊断学的金标准，
各种遗传疾病，病毒或细菌的感染与变异，在基因表达水平上的个性化用药，多基因疾病的诊断与预测，最终都可以借助基因测序平台的应用。
分子诊断技术的临床应用
4
三、基于扩增技术为基础的分子诊断技术 1983年Mullis发明了聚合酶链反应
分子诊断技术的临床应用
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荧光定量PCR检测TB-DNA的意义
1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高，特异性强
2. 早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核血液——播散性结核和各脏器的结核病脑脊液——中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病
于临床检测
分子诊断技术的临床应用
8
PCR技术
PCR核心技术是从水栖高温菌中
分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反
应不需要每一个循环加一次DNA聚合
酶，从而实现了自动化破性技术。
分子诊断技术的临床应用
9
PCR概述——2000至2013年发表论文篇
分子诊断技术的临床应用
2
根据分子诊断技术特征划分为三类：
一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在
碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交。分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交到聚合酶链反应（PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。
（Polymerase chain reaction，PCR），使体外扩增DNA成为可能，开启了体外扩增和操作DNA或RNA技术的发展。到现在，扩增DNA的技术已经成为分子诊断应用最广的技术之一，并发展变化了数十种核酸扩增检测技术。
分子诊断技术的临床应用
5
二、PCR概述
（一）PCR概念
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。是一项体外核酸扩增技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
分子诊断技术的临床应用
16
三、荧光定量PCR技术的临床应用
二肿瘤相关基因表达的检测： 1、包括癌基因、抗癌基因 2、肿瘤转移基因 3、转移抑制基因
分子诊断技术的临床应用
17
三、荧光定量PCR技术的临床应用
三遗传病 1、等位基因检测 2、多基因遗传病的突变检测 3、基因表达异常所致遗传病检测
分子诊断技术的临床应用