微生物降解金针菇栽培袋料中的棉酚研究

微生物降解酚类化合物的研究进展李淑彬;陈振军【摘要】酚类化合物是多种工业生产过程中排放的有毒污染物. 从微生物对酚类化合物降解的生化机制和关键酶、高效降酚微生物菌种的分离筛选和降解特性以及利用微生物细胞固定化技术处理酚类污染物的研究进展等方面对微生物降解酚类化合物研究进行综述,并对应用高效菌种处理含难降解污染物废水的前景和存在问题进行简要评述.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2005(000)004【总页数】7页(P136-142)【关键词】酚类化合物;微生物;降解【作者】李淑彬;陈振军【作者单位】华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631;华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631【正文语种】中文【中图分类】Q935酚类化合物是一类原生质毒物，对几乎所有生物均有毒杀作用，尤其对人体神经系统危害较大，其中苯酚、间甲酚都属于饮用水水源中需严格控制的污染物质.酚可使蛋白质凝固，水溶液中的酚可被皮肤吸收而引起中毒，含酚污水可使水中的生物死亡.当水源水中酚类化合物的质量浓度为0.002 mg/L时，加氯消毒就会产生氯酚恶臭；质量浓度超过0.00 5mg/L，水就不能饮用.因此，降低废水中的含酚量已成为当务之急[1].引起环境污染的酚类化合物主要包括苯酚和氯酚.苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、纺织等化学工业产生的废水中的主要污染物，它进一步与水中的氯作用产生的氯代酚是一种毒性更强的有机污染物.苯酚及其衍生物在水体中的扩散，对生态环境造成了损害，也威胁着人类的健康，因此美国环保署把苯酚列入优先污染物和65种有毒污染物之列，我国也把苯酚列入中国环境优先污染物“黑名单”之中[2].氯酚类化合物(CPS)被广泛用作木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和除草剂等，在亚洲、非洲和南美洲还用于血吸虫病的防治，其中2，4—二氯酚(DCP)和2，4 ，5—三氯酚(TCP)还大量用于农药，因此在许多工业化国家CPS的生产规模非常庞大.氯酚的毒性随其氯化程度的增加而增加，2—氯酚、2，4—二氯酚、2，4，6—三氯酚和五氯酚都是毒性很高的物质.酚类化合物的大量使用，使得大量的CPS污染物进入了环境，这类化合物在水中的溶解度大，结构稳定，不容易分解和转化，它们在自然界中的不断累积，给自然环境造成很大的危害.因此，清除环境中的该类化合物是人类面临的一大挑战[7，24].对含苯酚、氯酚等酚类化合物的废水处理手段主要有两大类[3～6]一类是通过物理或物化方法处理，如萃取法、吸附法、超声—过氧化氢联合法、湿式催化氧化法、超临界水氧化法、高压脉冲法等.前两者操作简便，但成本较高，用于生产上不经济；后几种方法属于当前的研究热点，但处理成本高，处理规模小，基本上还处于实验室研究阶段.另一类是生物处理方法，最常用的是传统的活性污泥法.活性污泥法是一种以活性污泥为主体的废水处理方法.该法目前已成为钢铁、焦化、煤气、炼油、木材防腐、合成橡胶、染料等工业废水治理的主要方法,该方法具有设备简单、处理条件温和、处理效果好、受气候条件影响小、二次污染小等优点.微生物作为废水处理中活性污泥的主体，是有毒物质分解转化的主要执行者.微生物处理法从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效微生物菌种，研究探讨其降解特性，通过生物固定化技术，有针对性地投加到已有的污水处理系统中，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力.1 降酚微生物的主要类群近几十年来，研究者们已从该类物质长期污染的环境中或相应的活性污泥中分离到大量的能降解酚类化合物的微生物.这些微生物主要包括：(1)细菌类.如根瘤菌(Rhizobia)、醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、假单胞菌(Pseudonomonas.sp)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、反硝化菌(Denitrifiying bacteria)、黄杆菌(Flavobacterium)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepaciaps )、罗尔斯通菌(Ralstonia)、红球菌(Rhodococcus)等；(2)丝状真菌类.如镰刀菌(Fusarium)、白腐真菌(Phanerochaete)、青霉菌(Penicillium)等；(3)酵母菌类.如假丝酵母菌(Candida)、麦芽糖假丝酵母(Landidamaltosa)、皮状丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)等.此外一些藻类也参与了苯酚类物质的降解过程.其中假单胞菌是降解氯酚类化合物最常见的微生物，不仅能降解多种氯酚，而且能降解氯苯、多氯联苯、硝基苯和多环芳烃等近100种有毒物质[10～12].黄孢原毛平革菌(Phanerochate chrysosporium)是对氯代酚化合物具有非专一性降解作用的真菌，还能降解菲、葱等多环芳烃和多氯联苯及其各种染料等[13].2 微生物降解酚类化合物的机制和关键酶国内外学者对酚类化合物的生物降解机制进行了很多的研究，特别是苯酚、氯酚的降解机制、代谢途径，目前已有较为统一的认识.苯酚的微生物降解大多在好氧的条件下进行.在有氧的条件下，苯酚首先分解为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解，最后形成三羧酸循环中间物.邻位和间位途径是两个独立的代谢系统,邻位途径产生β—酮基己二酸中间产物，间位途径产生α—酮基己二酸中间物[14～17].氯酚类化合物在不同条件下的降解路径不同，在好氧条件下，单氯酚和二氯酚在氧化酶的攻击下形成氯代邻二酚，邻二酚开环生成相应的氯代粘康酸或半醛，粘康酸内酯化过程中释放氯离子；高度氯代的化合物则是在氢氧化酶作用下生成氯代醌，并逐步脱去所有的氯原子生成苯酚后才开环.在厌氧或缺氧条件下，氯酚进行还原脱氯，在得到电子的同时去掉一个氯取代基[7].苯酚降解过程中，苯酚降解途径的第一个酶——苯酚羟化酶是降解苯酚的关键酶，该酶负责将苯酚转化为邻苯二酚；将邻苯二酚开环裂解为三羧酸产物，是由邻位和间位酶负责的.尽管微生物降解苯酚类物质具有不同的途径和酶系统，却均产生同一类酶——邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O，间位裂解)或1，2—双加氧酶(CatA，邻位裂解)，将中间产物——邻苯二酚进行开环裂解.这类双加氧酶(C23O，Cat A)在不同的降解菌中具有高度的同源性[17].参与2，4—DCP降解的多个酶中，起始几步降解反应的酶即2，4—DCP羟化酶、3，5—二氯儿茶酚1，2—双加氧酶、氯粘康酸环异构酶、反式氯双烯内酯异构酶和氯双烯内酯水解酶是关键酶.大量研究表明，微生物降解有机污染物的基因通常与质粒有关.对很多氯代芳香化合物来说，往往是降解性质粒参与编码降解途径的一部分，剩余部分由染色体基因控制.根据对真氧产碱杆菌JMP134( pJP4)对2，4—D的降解过程及其控制基因的研究，从2，4—D至氯代马来乙酸之间降解过程受质粒pJP4控制，氯代马来乙酸及之后的降解过程受染色体控制.从这些情况来推测dcpA基因可能位于质粒上[18].3 微生物对酚类物质的降解特性研究沈锡辉[19]等分离到一株能以苯酚、苯甲酸、对甲酚、苯为唯一碳源和能源生长、具有同时降解单环和双环芳烃能力的细菌菌株，经生理生化、16SrRNA基因序列分析等鉴定为红球菌PNAN5菌株.在温度为20～40℃，pH7.0～9.0范围内该菌株降解苯酚的效率保持在80%～100%之间，苯酚浓度在2～10 mmol/L范围内变化对降解效率没有明显的影响.该菌株通过邻苯二酚1，2-双加氧酶催化的开环途径降解芳烃，不同于已知的浑浊红球菌，后者是通过邻苯二酚2，3-双加氧酶催化芳烃降解.刘慧等[20]探讨了初始苯酚浓度、TOC以及酵母生物量间的相互关系.结果表明，苯酚的降解同酵母生长有极大的相关性，初始苯酚浓度升高，抑制酵母生物量增加，转化率下降；在苯酚的降解过程中，TOC的下降与苯酚同步，苯酚完全降解后TOC主要来自酵母代谢产物.对于初始苯酚质量浓度为559.0 mg/L的培养液，降解90%的苯酚可获得酵母328.2 mg(生物量)/L，并可使培养液TOC降解约87.3%.宋波[21]等对南充市郊炼油厂活性污泥进行富集、驯化筛选得到2株能以苯酚作为唯一碳源和能源生长的菌株，分别编号为S1、S2，在苯酚质量浓度<300 mg/L 时，该两株细菌对苯酚降解率均高于60%.实验得出其最佳生长条件为pH 7～8，温度25～30℃.向述荣等[22]对分离筛选到的一株高效苯酚降解菌phen8(假单胞菌)的底物降解特性进行了分析，并筛选出4株缺失苯酚降解功能的突变株.结果表明，在苯酚初浓度为0～7 mmo1/L时，苯酚降解菌phen8的菌体密度和降解率与培养基中的苯酚初浓度成正比，而大于7 mmo1/L的苯酚则明显地抑制降解反应.葡萄糖对苯酚的降解也表现出明显的抑制作用.与对照相比，在含有葡萄糖的基本培养基中培养20 h后，菌体对苯酚的降解率减小47.2%.陈明、张维、徐玉泉等[23]用从炼油厂污水中分离的醋酸不动杆菌PHEA-2研究降解苯酚的能力，发现该菌种对苯酚有较强的降解能力.在温度30℃和接种量为1%条件下，在24 h内完全降解苯酚的质量浓度为300 mg/L，而且降解反应遵从Monod模式.他们还用经多次驯化的菌种来做降解苯酚的研究，从pH、温度等方面考察了该菌的降解特性，得出最佳温度为30℃和pH在5～9之间的结论.另外，任源等[24]用从处理废水系统中的活性污泥里分离、驯化得到的菌种来处理油制气废水，并对其降解特性进行了研究.发现该菌对酚类化合物的去除率达95.4%～97.0%，还考察了其他营养源对降解率的影响，他们的研究结果表明葡萄糖、乙醇的加入可提高菌种对CODCr和氨氮的去除率.钟文辉等[25]从土壤中分离到两株能以2，4—二氯酚为唯一碳源和能源生长的、具有降解2，4—二氯酚能力的假单胞菌属细菌GT241-1和GT141-2.菌株GT241-1和菌株GT141-2在最适温度25～30℃下，能将60～100 mg/L的2，4—二氯酚分别降解到8～12 mg/L和25～30 mg/L.经驯化的活性污泥在投加污泥总量0.59% (以干重计)的GT241-1菌体后，对含2，4—二氯酚60 mg/L和COD 1 500 mg/L的模拟废水分批处理20 h左右后可使2,4—二氯酚含量降到最低值9 mg/L.黄俊等[26]采用室内培养法，研究了白腐真菌的典型菌种——黄孢原毛平革菌对典型浓度的五氯酚(PCP)溶液的好氧生物降解.结果表明，在常温条件下，经过6 d 时间，初始浓度为20 mg/L的PCP接近完全降解，效果非常显著.对实验所获得的时间序列数据进行动力学分析，发现该菌对PCP的生物降解反应遵循准一级动力学.宋建华等[27]从处理曾受五氯酚污染的废水处理设施的活性污泥中经过驯化富集获得一株PCP降解菌.在24 h内，该菌对质量浓度为400 mg/L的PCP降解率在90%以上.经检测该菌属于假单胞杆菌.并从底物浓度、温度、pH、接种量和添加低浓度其他营养源方面研究该微生物对底物的降解特性.陈勇生等[8]分离到2株可利用2，4—二氯酚为唯一碳源和能源的假单胞菌DCP-1和DCP-2.在此基础上，研究探索了菌株DCP-1降解2，4—二氯酚的影响因素和降解过程以及其遗传特性.结果表明：菌株DCP-1可降解2，4—二氯酚，并有氯离子、邻氯酚和醌积累；菌株DCP-1降解2，4—二氯酚要经历脱氯，并生成中间产物醌的过程；经检测该菌株中有一条迁移速率比pUC 18小的质粒；菌体培养至60 h，其生长量达到最大，此时2，4—二氯酚降解率可达92%.笔者从某钢铁厂污水中分离驯化了两株苯酚降解菌A、D，对其降解速率、生长温度、pH范围、耐受浓度等降解特性进行了初步研究.其中A菌可以在16 h将800 mg/L苯酚溶液降解完全，D菌13 h可以达到上述效果，两株菌的最高耐受浓度均高达2 350 mg/L，其降解速率和耐受浓度在已知报道中都是较高的.4 固定化微生物细胞对酚类化合物的降解固定化微生物技术用于废水处理,具有一系列优点,如可在反应器内保持高生物浓度,反应启动快、处理效率高,操作稳定,产污泥量少,固液分离简单、对有毒物质的承受能力和降解能力较游离细胞高等特点.因此,该技术在难降解有机污染物治理中越来越受到关注.表1列举了近年来细胞固定化技术对酚类物质的降解研究的一些实例. 表1 固定化微生物细胞对酚类化合物的降解被降解物质微生物/酶酶固定化载体/方法处理负荷/(mg·L-1)处理效果参考文献苯酚驯化后的活聚乙烯醇———180．76h后降解率为89%28性污泥活性炭包埋法2148．024h后降解率为50%假单胞菌海藻酸钙包埋915吸附出水9．2mg/L29假单胞菌藻阮酸钙包埋1000去除率大于90%5恶臭假单胞菌聚乙烯醇-硼酸法100连续将苯酚浓度降低到2．5mg/L30优势菌群聚乙烯醇冷冻改良法565去除率达94%以上，比游离菌群高10%～50%31小球藻细胞、紫色光合细菌混合菌株海藻酸钠包埋300出水0．5mg/L32假单胞菌聚矾纤维膜固定120095h内可完全降解33五氯酚活性污泥海藻酸钙和15012h后降解率大于85%34聚乙烯醇法28016h后降解率大于75%2—氯酚白腐菌硅胶载体和轻木颗粒包埋500将80%～94%氯酚降解为CO2、H2O、和无机氯132，4，6-三氯酚厌氧和好氧污泥k角叉藻聚糖/明胶凝胶100固定后则可以矿化，寿命延长，降解率提高．362-氯酚，2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚荧光假单胞菌海藻酸钙60040010050h后降解率分别达到66%，80%，50%37多氯酚混合菌固定化细胞三相流化床反应器400～430g/(m3∗d)氯释放和氯酚去除率达99%355 总结和展望从受污染的环境中分离获得高效的酚类物质降解菌，研究其降解特性，然后应用到含酚等难降解污染物的废水处理系统中，是难降解污染物的废水处理的一条有效途径；另外，固定化技术用于难降解有机物治理的研究大多是针对单一物质，且在实验室规模上进行的，要实用化，还有许多问题需要解决.(1)含酚废水是比较普遍、危害性很严重的工业废水之一.对废水中酚类物质的脱除一直是国内外研究工作者研究的热点.但大多数研究者所研究酚的浓度较低(一般在500 mg/L以下).但实际上许多工厂，如有的焦化厂排放的废水中酚类物质的含量达几千甚至几万mg/L.对于这样高浓度含酚废水进行生物学研究和处理，目前国内外报道的还不多.(2)实际废水是一个十分复杂的混合体系，用单一菌种处理，一般很难达到要求，因此，对于复杂的废水体系，是采用混合菌，还是单一高效菌分级处理，有待进一步探索，因此，实验室的研究与实际应用还有一段很大的距离.现在，已有学者在探讨混合基质的污染物共代谢机理，以及混合菌种体系中的生物协同作用，可以提高菌的稳定性和处理效率，将成为今后的一个发展方向.(3)防止二次污染问题.随着基因工程的发展，在高效菌种的选育上也逐渐采用现代生物技术，如用物理、化学因子处理诱变菌株，用基因重组或细胞融合技术创建高效优势菌等.对这些诱变菌的利用要考虑在泄漏情况下该菌对周围生态环境的影响.固定化技术为充分发挥高效菌种或遗传工程菌在难降解有机物治理中的降解潜力，防止其泄露而引起生态问题提供了一个十分重要的手段.(4)包埋载体对基质(特别是氧气)和产物存在扩散阻力，因此，需要高效曝气和混合设备才能使固定化细胞处于良好的微环境中，发挥其高效作用.(5)固定化载体的成本及使用寿命是决定其经济可行性的关键，开发适合于固定化微生物的高效生化反应器也是一个就亟待解决的问题.经固定化微生物处理过的废水，出水透明度一般较差，完善处理工艺，是今后需要考虑的问题.可以预计，随着高效菌种的研究和固定化技术的不断研究和发展，在降解酚类化合物废水的处理方法中的应用必将更上一层楼.参考文献：[1] 李绍峰,孙连鹏,黄君礼.UV/H2O2降解酚类物质动力学研究[J].中山大学学报(自然科学版),2004,43(3):99-102.[2] 金相灿.有机化合物污染化学-有毒有机物污染化学[M].北京：清华大学出版社.1990：250-253.[3] 方振炜,徐德强,张亚雷，等.酚类化合物的生物降解研究进展[J].环境污染与防治,2003,4:383-388.[4] 张海涛.我国含酚废水处理技术研究进展[J].上海环境科学，2001，2(20)：60-62.[5] 于萍，姚琳，罗运柏.高浓度含酚废水处理的新工艺[J].工业水处理,2002,22(9):5-8.[6] HUBAN C M,PLOWMAN R D.Bioaugmentation:Put microbes 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环境激素双酚A降解菌的分离、鉴定及初步应用研究的开
题报告
一、研究背景
双酚A（BPA）是一种广泛应用于塑料、树脂等工业产品中的化学物质，在食品
包装材料和日用品中大量使用。

然而，BPA被研究发现具有环境激素活性，会干扰内
分泌系统的正常功能，引起一系列健康问题，如生殖障碍、肥胖、糖尿病等。

因此，
如何有效降解环境中的BPA成为一个迫切的问题。

微生物降解是一种绿色、低成本、高效的BPA降解方法，已经成为了一种研究
热点。

因此，本研究旨在从自然环境中分离具有BPA降解功能的菌株，对其进行鉴定
和功能分析，以期为BPA降解菌的筛选及应用提供科学依据。

二、研究内容和方法
1.菌群的分离和筛选
本研究将选取一些具有高污染风险的环境样品（如化工厂废水、生活污水等）作为菌群的来源。

将样品经过一系列的稀释操作后，采用接种平板法和培养基涂抹法等
方法，从样品中筛选出能够降解BPA的菌株。

2.菌株的鉴定和功能分析
对筛选出的菌株进行16S rDNA序列分析，确定其系统发育关系，并对其产酶特性、生理生化特性等进行研究。

同时，通过高效液相色谱法（HPLC）等方法分析BPA 的降解效果。

3.初步应用研究
通过模拟实验和自然环境实验等方式，探究分离菌株在BPA降解过程中的适应
性和活性，为其在BPA污染治理方面的应用提供参考。

三、研究意义
本研究可为BPA污染治理提供科学依据，为环境保护工作提供技术支撑。

同时，从环保的角度出发，探究微生物降解BPA的机理和途径，为微生物工程的应用提供理
论基础。

高效苯酚降解菌的选育及降酚性能研究的开题报告一、研究背景和意义苯酚是一种广泛存在于工业废水、污水和各种有机物的代表性污染物之一，具有较强的毒性和臭味。

苯酚的降解对于保护环境、维护健康具有重要意义。

生物降解是一种最为有效的方法之一，其中利用菌类对苯酚进行降解具有广泛应用前景。

因此，针对高效苯酚降解菌的选育及降酚性能研究具有重要的科学研究价值和应用价值。

二、研究内容和方案本研究将通过以下步骤完成：1. 采集大量土壤样品，进行菌群分离培养，筛选出能够高效降解苯酚的菌株。

2. 利用传统鉴定方法和分子生物学技术对分离得到的菌株进行鉴定和分析，确定其分类地位、基本形态特征、生理生化特性和分子机制等。

3. 对菌株的优化培养条件进行研究，包括温度、pH值、质量浓度和营养成分等方面，筛选出最佳生长条件以及最佳降解苯酚条件。

4. 对菌株进行苯酚降解性能测试，研究其对不同浓度苯酚的降解速率和降解效率。

5. 研究菌株的代谢途径和代谢产物，探究降解苯酚的分子机制。

三、预期结果1. 筛选出一种高效降解苯酚的菌株。

2. 通过鉴定和分析，对该菌株的分类地位、基本形态特征、生理生化特性和分子机制进行了研究。

3. 确定该菌株的最佳生长条件和最佳降解苯酚条件。

4. 研究该菌株的苯酚降解性能，包括降解速率和降解效率等方面的数据并进行分析。

5. 推测该菌株的代谢途径和代谢产物，探究降解苯酚的分子机制。

四、研究意义和应用前景本研究将为高效苯酚降解菌的选育和降酚性能研究提供重要依据和参考数据，为工业废水和污水的治理提供实用的技术手段和科学依据。

同时，对开展生物降解技术和环境保护工作具有重要的意义和价值。

“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案丁霞一、实验目的酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。

焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。

含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。

利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。

本项目拟采用微生物培养、苯酚生物降解的途径及其降解关键酶的分析、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株的生长特性和苯酚的生物降解特性，苯酚降解菌的系统发育。

对学生从事有机污染工业废水的生物处理以及有机污染的土壤或水体的生物原位修复方面的科学研究具有深远的意义。

二、实验原理利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液，对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养，从中分离筛选出苯酚降解菌。

利用比浊法测定微生物生长量，4-氨基安替比林直接光度法测定苯酚浓度，分析苯酚生物降解的途径及其降解关键酶，PCR扩增细菌的16s RNA进行苯酚降解菌的系统发育分析。

1）微生物生长量的测定方法——比浊法比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。

该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度将被减弱。

入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。

根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。

本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。

2) 苯酚浓度的测定方法见后面附录。

3）苯酚降解菌的系统发育分析16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。

16S rRNA具有高度的保守性和特异性。

随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为微生物检测和鉴定的一种强有力工具。

该技术主要有三个步骤：首先，基因组DNA的获得；其次，16S rRNA基因片段的PCR扩增，并进行TA克隆用于测序分析；最后，进行16S rRNA基因序列的系统发育分析。

棉籽饼中棉酚降解菌株的分离及脱毒效果初探摘要从棉田土壤中分离筛选对棉酚具有降解作用菌株,得到1株具有较高降解活性的菌株,命名为m12。

经鉴定,初步确定菌株m12为鲁氏毛霉(mucor rourianus),进一步脱毒研究表明,菌株m12具有降解棉籽饼中游离棉酚的能力,降解率在80%以上,具有进一步开发的潜力。

关键词棉酚降解菌株;棉籽饼;筛选;鉴定;生物脱毒中图分类号s476 文献标识码a 文章编号1674-6708(2010)23-0091-02我国是一个产棉大国,而棉籽饼中粗蛋白含量达到34%~38%,高出大米和小麦5~8倍[1,2],可作为一种理想的蛋白质饲料,一定程度上弥补我国蛋白饲料资源的不足。

但是,棉籽饼中含有游离棉酚,直接利用可引起动物棉酚中毒,给养殖户造成巨大的损失[3]。

因此,对棉籽饼进行脱毒处理,从而更高效、更安全的利用棉副产品对于畜牧养殖业来说意义重大。

本文是从棉田土壤中筛选能够降解棉籽饼中棉酚的高效菌株,并对其实际应用效果进行了初步验证,希望为棉籽饼这一丰富的粗饲料资源能更好的应用于畜牧业生产贡献一份力量。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 棉籽饼来源所用棉籽饼原料是河北保定河间某榨油厂的普通压榨油饼,在实验室经过粉碎等工序,使其成为细度为筛孔直径小于0.25 mm的棉籽饼粉。

1.1.2 培养基棉酚培养基平板:将棉酚5 g加50 ml pda培养基加入50 ml蒸馏水,制成平板。

棉酚培养液:棉酚5 g加入100 ml pda培养液。

固态发酵培养基:由棉籽饼和玉米粉等成分组成。

生理生化鉴定培养基,pda培养基见《真菌鉴定手册》[4]。

1.2 方法1.2.1 游离棉酚标准曲线测定制备棉酚标准溶液,采用间苯三酚法[5]测定各样品溶液的吸光度。

根据样品溶液棉酚含量(μg)和测定的吸光度值绘制标准曲线并进行回归计算。

1.2.2 棉酚降解菌株的初筛采用常规涂布法,将土样稀释液涂布棉酚培养基平板,37℃培养。

高效降解棉酚菌种筛选、降解机理及固体发酵工艺研究棉籽粕具有较高的蛋白含量,是重要的植物源蛋白饲料原料,但其中含有棉酚及其他一些抗营养因子,这些抗营养因子对动物具有一定的毒害作用,从而极大地限制了其在畜牧生产中的饲用价值和使用量。

为了提高棉籽粕的营养价值,早期研究提出了硫酸亚铁处理、氢氧化钙处理和有机溶剂浸提等一些脱毒方法,对棉籽粕的脱毒起到了重要作用,但却也存在着较多弊端。

微生物发酵法是一种新型的脱毒方法,它不仅可以很好地达到脱毒的效果,同时还可以提高棉籽粕的营养价值,具有广阔的发展前景,近年来受到越来越多的重视。

本课题通过高效降解棉酚菌种的选育,发酵工艺参数的优化,对微生物发酵法脱毒效果及其影响因素进行了考察分析,并采用分子生物学方法对微生物发酵脱毒的机理进行了研究。

主要研究成果如下:1、棉酚降解菌的筛选。

通过采样、初筛和复筛等系统方法对棉酚降解菌株进行了筛选,得到四株棉酚降解率较高的菌株,然后采用形态学观察和分子生物学方法进行了菌种鉴定,最终确定四株菌分别为粪肠球菌（Enterococcus faecalis ）,原玻璃蝇节杆菌（ Arthrobacter protophormiae ）,干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）,近平滑假丝酵母菌（Candida parapsilosis）,并选用近平滑假丝酵母菌（C. parapsilosis KDN0118）作为主要生产菌株。

2、利用单因素法和统计学方法对C. parapsilosis KDN0118种子液体发酵的培养基成分和发酵条件进行了优化。

首先利用单因素法确定了最佳碳源、最佳氮源以及初始pH、温度、转速、装液量、发酵时间的最适范围,然后采用Plackett-Burman（PB）实验设计筛选出对发酵菌量具有显著影响的关键因素酵母膏、K₂HPO₄、MgSO₄和发酵时间,最后通过Box-Behnken实验设计和SAS软件回归分析建立发酵菌量关于四个关键因素的二次多项式回归模型,并通过响应面分析法和典型性分析得出培养基最佳成分和最优发酵条件:酵母膏44.3 g/L、K₂HPO₄ 7.3 g/L、MgSO₄ 0.96 g/L,发酵时间为31.1 h,预测最大发酵菌量Ymax为6.55×109 cfu/mL。

专利名称：一株棉酚降解菌株及其应用专利类型：发明专利
发明人：高峰,林海晶,夏新成,江芸,周光宏申请号：CN201110004049.0
申请日：20110110
公开号：CN102154130A
公开日：
20110817
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于微生物领域，公开了一株棉酚降解菌株及其应用。

假丝酵母GJ-D-
25(Candidarailenensis)，该菌株于2010年11月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4373。

该菌株对醋酸棉酚的降解率为91.40％，CP提高率为24.99％，并且该菌株有很好的稳定性，使棉籽粕达到使用标准，加大棉籽粕的利用率。

本发明对于缓解蛋白质资源紧缺，减少大豆进口及棉籽粕廉价出口日本，控制蛋白质资源价格的不断攀升，增强国力，具有重要的意义。

申请人：南京农业大学
地址：210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号
国籍：CN
代理机构：南京天华专利代理有限责任公司
代理人：徐冬涛
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高效降解棉酚菌种筛选、降解机理及固体发酵工艺研究高效降解棉酚菌种筛选、降解机理及固体发酵工艺研究摘要：棉酚是一种强毒化合物，常见于废水和固体废弃物中。

为了有效降解棉酚，本研究使用固体发酵技术筛选出高效降解棉酚的菌种，并研究了其降解机理。

结果显示，产棉酚菌株L28具有卓越的降解能力，并通过红外光谱和高效液相色谱等分析方法，阐明了棉酚降解的机理。

此外，该菌株在固体发酵过程中的适宜条件也得以探究。

1. 引言棉酚是一种具有强毒性的有机化合物，常见于棉纺织、印染、造纸和药物制备等工业过程中。

废水和固体废弃物中富含棉酚，对环境和人体健康构成严重威胁。

因此，有效降解棉酚具有重要的环保和应用价值。

2. 方法2.1 菌种筛选本研究从污水处理厂的污泥中分离得到一株具有棉酚降解潜力的细菌。

将该菌株分别接种在含有棉酚的琼脂平板上，并通过观察周围环境的溶解圈来筛选降解能力高的菌株。

2.2 降解能力测定通过测定不同菌株在含棉酚液体培养基中降解棉酚的能力，筛选出高效降解棉酚的菌株。

用高效液相色谱法测定降解液中棉酚的含量。

2.3 降解机理研究选取具有较高降解能力的菌株，进行进一步研究其降解机理。

收集并分析降解液的红外光谱和高效液相色谱等数据，探究棉酚降解的产物和反应过程。

2.4 固体发酵工艺优化通过单因素实验和正交实验，研究固体发酵过程中的温度、pH 值、培养基含量等因素对菌株降解效果的影响。

确定固体发酵过程中的最佳操作条件。

3. 结果与讨论3.1 菌种筛选经过筛选，得出一株具有较高降解棉酚能力的菌株L28。

3.2 降解能力测定菌株L28在含棉酚培养基中进行实验，发现在72小时内，棉酚的降解率可达到90%以上。

3.3 降解机理研究通过红外光谱分析，发现菌株L28在降解棉酚过程中，将酚羟基的C-O键断裂，生成酚环上的双键结构。

同时，通过高效液相色谱分析，确定了降解反应的中间产物。

3.4 固体发酵工艺优化固体发酵实验结果表明，在37°C、pH值为7.0、固体培养基含量为50%的条件下，菌株L28的降解效果最佳。

高效降解棉酚菌株的选育及发酵棉粕最佳工艺的研究陈生琴;陈丽娟;程茂基;周媛媛;高燕【摘要】利用醋酸棉酚作为唯一碳源,筛选出一株高效降解棉酚的菌株RE-1.通过扫描电镜和16S rRNA分子学鉴定该菌为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis),GenBank序列登录号为KR906527.扫描电镜和透射电镜观察固体LB培养基和棉酚培养基中的RE-l菌株可知,棉酚会通过破坏菌体细胞膜通透性的方式来抑制RE-l的生长.实验确定的棉粕最优发酵条件为RE-1接种量20％、时间8d、温度34℃、pH 5.0、料水比1∶0.5,最优条件下棉酚的降解率达到72.54％,棉粕中粗蛋白质含量提高了21.38％,粗纤维含量降低了20.26％,释放出营养物质,提高了棉粕的消化利用率.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2016(041)004【总页数】6页(P19-24)【关键词】醋酸棉酚;棉粕;红平红球菌;发酵;菌种鉴定【作者】陈生琴;陈丽娟;程茂基;周媛媛;高燕【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,合肥230036【正文语种】中文【中图分类】TS229;S816油料蛋白随着畜牧业的快速发展，饲料的需求量越来越大。

棉粕是一种重要的蛋白饲料，棉粕中粗蛋白质含量占40%左右，粗纤维约11%，此外B族维生素、硫胺素和有机磷也比较多[1-2]。

但由于棉粕中有抗营养因子棉酚存在，限制了棉粕的利用。

棉酚是存在于棉粕中的一种对动物有害的物质，因此大部分棉粕只能用作肥料，而这种高蛋白饲料作为动物饲料蛋白源，其利用率不足30%，造成了蛋白资源的极大浪费[3]。

若能开发一种经济有效的棉粕脱酚生产工艺或研制出降解棉酚的酶制剂，使其在饲料中普遍应用，对解决我国蛋白资源严重短缺的问题将发挥重大作用[4]。