下载文档原格式
人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化人乳酸脱氢酶a基因在细胞过程中起着至关重要的作用。
对于这个主题，我们将从原核表达开始深入探讨，并结合蛋白的纯化过程，逐步展开全面评估和详细讨论。
1. 人乳酸脱氢酶a基因的重要性人乳酸脱氢酶a基因是一种编码人体内催化丙酮酸还原为乳酸的酶的基因。
该基因的表达与细胞内能量代谢息息相关，对于维持细胞内稳态至关重要。
深入了解这一基因在细胞中的表达和功能具有重要意义。
2. 原核表达的意义和挑战在研究人乳酸脱氢酶a基因时，选择合适的表达系统是至关重要的。
原核表达系统由于其高效、简便以及成本低廉而备受青睐。
然而，在原核表达过程中仍然存在着诸多挑战，例如蛋白的溶解和折叠问题，对于这些问题的解决将直接影响目标蛋白的纯化。
3. 蛋白的纯化过程蛋白的纯化过程对于后续实验的结果和分析至关重要。
在纯化过程中，采用合适的方法和技术能够有效地去除杂质，确保目标蛋白的纯度满足后续实验的需求。
4. 个人观点和理解在进行人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化过程中，科学家们需要克服不少困难，但一旦成功将获得来自对基因和蛋白的深入理解。
对于这一主题，我认为深入挖掘其相关的细胞机制，有利于我们更好地理解细胞内的代谢过程，从而为细胞生物学和分子生物学领域的研究提供重要参考。
总结回顾在本文中，我们深入探讨了人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化过程。
通过从原核表达的意义和挑战开始，逐步对蛋白的纯化过程展开论述，希望能够给读者带来全面、深刻和灵活的理解。
在探讨的过程中，我们也共享了个人的观点和理解，期望能够引发更多学术讨论和思考。
以上是一篇有关人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化的文章，希望对你有所帮助。
人乳酸脱氢酶a基因的原核表达及其蛋白的纯化是生物技术领域中一个极其重要的课题。
通过对这一过程的研究，人们可以更深入地了解基因的表达调控机制，以及蛋白质的结构和功能特点。
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2荧光探针研究新进展章晓波 徐 洵(国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005)摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。
Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。
为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。
固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。
最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。
本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。
关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR1 常规荧光探针固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。
Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。
他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。
当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。
后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。
人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及纯化作者：林红梅王泽玉邵玥秦晓晔刘诗超张鑫杨利民来源：《中国中药杂志》2013年第23期[摘要] 研究提取人参叶中的总RNA，采用RT-PCR扩增人参叶Cu/Zn-SOD基因，构建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体。
使用Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达。
利用镍离子亲和层析进行纯化，并采用黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活。
经RT-PCR扩增的人参Cu/Zn-SOD基因序列与GenBank数据库中公布的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列同源性为99.00%。
经IPTG诱导，目的蛋白的表达量约为44.42%，相对分子质量为16.30 kDa。
纯化后的蛋白酶活可达到10 596.69 U·mg-1。
通过分子生物学方法，成功构建了人参pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体，为进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能奠定了基础。
[关键词]人参；Cu/Zn-SOD；原核表达人参为五加科Araliaceae植物人参Panax ginseng C.A.Mey的干燥根及根茎，是我国名贵中药。
现代研究表明人参中富含皂苷、挥发油、蛋白质、糖类、脂肪酸、无机元素等多种化学成分[1-2]。
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是一种能清除生物体内产生的超氧阴离子自由基（O2）的金属蛋白酶类[3]，广泛存在于一切生物体内。
该酶具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗癌等多种药理作用[4-6]。
SOD根据辅基部位结合的金属离子的不同，可分为Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD，其中Cu/Zn-SOD是平衡机体O2的主要蛋白[7-8]。
以往对人参化学成分的研究大多集中于皂苷、糖类以及挥发性成分，而对人参Cu/Zn-SOD的研究报道很少。
本研究从人参叶中克隆Cu/Zn-SOD基因，构建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD表达载体并诱导其表达，经镍离子亲和层析纯化目的蛋白，为探索人参Cu/Zn-SOD产业化工艺流程以及进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能提供试验依据。
原核表达并纯化沙眼衣原体(Ct)巨噬细胞感染增强因子MIP的免疫活性分析史桂桃;陆春雪【摘要】目的原核表达并纯化沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)巨噬细胞感染增强因子MIP,评价其作为Ct疫苗候选蛋白的可行性.方法采用PCR技术从Ct D型基因组中扩增MIP基因,构建pGEX-6p-1/MIP原核表达质粒,转化E.coli XLl-Blue,IPTG诱导重组GST-MIP融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb/c鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体和脾细胞因子的产生情况.结果成功构建了pGEX-6p-1/MIP原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的Ct D型一致,长度为729 bp;GST-MIP融合蛋白在E.coli中获得稳定高效表达,纯化后纯度达90％以上;MIP蛋白免疫小鼠产生高滴度、高特异性的IgG抗体,以IgG2a亚型为主;MIP蛋白免疫小鼠的脾细胞受衣原体菌体或MIP 蛋白刺激,产高水平IFN-γ.结论原核表达并纯化了Ct MIP蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度抗体和Thl型免疫应答,可能为潜在有效的Ct亚单位疫苗.【期刊名称】《中国中西医结合皮肤性病学杂志》【年(卷),期】2018(017)004【总页数】4页(P307-310)【关键词】沙眼衣原体;巨噬细胞感染增强蛋白;克隆表达;纯化;疫苗【作者】史桂桃;陆春雪【作者单位】内蒙古医科大学附属医院,内蒙古呼和浩特,010050;南华大学医学院病原生物学研究所,湖南衡阳421001【正文语种】中文【中图分类】R392沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是一类专性细胞内寄生的原核细胞型微生物，包括A、B、C、D等19种血清型，其中D-K型可引起人类泌尿生殖道感染。
Ct是细菌性性传播疾病最常见的病原体，感染者可出现盆腔炎、不孕不育等严重并发症[1]。
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。
原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。
然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。
为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。
其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。
镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。
通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。
在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。
然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。
接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。
最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。
镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。
通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。
然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。
综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。
随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。
文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。
专利名称：一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法和转化油菜的方法
专利类型：发明专利
发明人：周波,彭丹
申请号：CN201510847854.8
申请日：20151127
公开号：CN105255940A
公开日：
20160120
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法和转化油菜的方法，利用乌桕的SsPDAT1基因，构建该基因的植物组成型表达载体，并将其转化甘蓝型油菜，通过抗性筛选，RT-PCR鉴定和油酸含量分析等获得高油酸含量的转基因油菜植株。
分析发现，转基因植株的含油量比野生型明显增加。
结果表明：通过遗传转化培育出了一个高油酸含量的转基因油菜。
申请人：中南林业科技大学
地址：410004 湖南省长沙市韶山南路498号
国籍：CN
代理机构：长沙市融智专利事务所
代理人：袁靖
更多信息请下载全文后查看。
西北植物学报，２０１４，３４（３）：０４４４－０４４８Ａｃｔａ Ｂｏｔ．Ｂｏｒｅａｌ．－Ｏｃｃｉｄｅｎｔ．Ｓｉｎ． 文章编号：１０００－４０２５（２０１４）０３－０４４４－０５ ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－４０２５．２０１４．０３．０４４４收稿日期：２０１３－１１－２１；修改稿收到日期：２０１４－０１－２４基金项目：中南林业科技大学青年基金（ＱＪ２０１１０４６Ｂ）；中南林业科技大学人才引进项目（１０４－０１８２）；国家自然科学基金青年基金（３１２００５１６）；湖南省教育厅优秀青年基金（１３Ｂ１５０）作者简介：周 波（１９８０－），男，博士，讲师，主要从事林业生物技术方面的教学与科研工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｂｏ６４０９＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者：谭晓风，教授，博士生导师，主要从事林业生物技术研究，Ｅ－ｍａｉｌ：３８３５５９５３０＠ｑｑ．ｃｏｍ乌桕ＳｓＳＡＤ基因的原核表达与纯化研究周 波１，２，３，彭 丹１，２，３，张 琳２，３，谭晓风２，３＊，刘选明４（１中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙４１０００４；２中南林业科技大学经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，长沙４１０００４；３中南林业科技大学经济林培育与利用湖南省协同创新中心，长沙４１０００４；４湖南大学植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室，长沙４１００８２）摘 要：乌桕是一种重要的木本油料树种。
ＳＡＤ（ｓｔｅａｒｏｙｌ－ａｃｙｌ ＡＣＰ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）是油料植物中将饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸的一种关键脱氢酶。
为了进一步揭示乌桕ＳｓＳＡＤ的功能，该研究在大肠杆菌中表达了该蛋白。
结果表明：（１）通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法从乌桕种子中克隆出了ＳｓＳＡＤ基因编码区全长序列，并将其克隆到低温诱导的原核表达载体ｐＣｏｌｄ ＴＦ上，构建原核重组表达载体ｐＣｏｌｄ ＴＦ／ＳｓＳＡＤ，转化大肠杆菌ＢＬ ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）并获得原核表达工程菌株。
（２）通过ＩＰＴＧ法低温诱导表达融合蛋白。
该重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达，融合蛋白分子质量约为１０１ｋＤ，且在上清液和包涵体中均有表达，可溶性部分经亲和层析纯化和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测证实获得了重组蛋白，上述结果为进一步研究乌桕ＳｓＳＡＤ的结构和功能奠定了基础。
关键词：ＳｓＳＡＤ基因；ｐＣｏｌｄ ＴＦ；原核表达；融合蛋白；纯化中图分类号：Ｑ７８５；Ｑ７８６文献标志码：ＡＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳｓＳＡＤＧｅｎｅ ｆｒｏｍＳａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍＺＨＯＵ Ｂｏ１，２，３，ＰＥＮＧ Ｄａｎ１，２，３，ＺＨＡＮＧ Ｌｉｎ２，３，ＴＡＮ Ｘｉａｏｆｅｎｇ２，３＊，ＬＩＵ Ｘｕａｎｍｉｎｇ４（１Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００４，Ｃｈｉｎａ；２ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｏｎ－Ｗｏｏｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎ－ｇｓｈａ ４１００４，Ｃｈｉｎａ；３Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｎｏｎ－Ｗｏｏｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４，Ｃｈｉｎａ；４Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｈｕｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｏｉｌ ｔｒｅｅｓ．ＳＡＤ（ｓｔｅａｒｏｙｌ－ａｃｙｌ ＡＣＰ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｔｏ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙａｃｉｄ ｉｎ ｏｉｌ ｐｌａｎｔ．Ｗｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＳｓＳＡＤ ｆｒｏｍ Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ：（１）Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＳｓＳＡＤ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲｆｒｏｍＳａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣｏｌｄ ＴＦ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｇａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅ－ｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ．（２）Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ １０１ｋＤ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔ ｂｏｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｌｌｅｔ ｐａｒｔｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｌｙｓａｔｅｓ．Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ｗｈｉｃｈ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａ－ｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳｓＳＡＤ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＳｓＳＡＤ（Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍｓｔｅａｒｏｙｌ－ＡＣＰ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）ｇｅｎｅ；ｐＣｏｌｄ ＴＦ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 乌桕（Ｓａｐｉｕｍ ｓｅｂｉｆｅｒｕｍ）属大戟科乌桕属多年生高大落叶乔木，与油茶、油桐、核桃合称为中国四大木本油料树种。
其果仁含油率高达６５．７６％［１］。
乌桕梓油中富含油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸，含量在９０％左右［２］，是制造生物柴油的理想原料［３］。
因此，乌桕曾被日本科学家誉为“绿色原子弹”。
前人研究结果表明：硬脂酰ＡＣＰ脱氢酶ＳＡＤ是高等植物中脂肪酸合成代谢的关键酶。
它催化硬脂酰ＡＣＰ在Ｃ９和Ｃ１０之间引进一个双键形成油酰－ＡＣＰ。
硬脂酰ＡＣＰ脱氢酶在植物脂肪酸从头合成途径的最后一步发挥作用，它的脱氢产物是形成许多多不饱和脂肪酸的前体。
ＳＡＤ基因在农作物的土豆［４］、水稻［５］、油菜［６］、芝麻［７］、大豆［８］和花生［９］等植物中都已经被克隆，有了较深入的功能研究；在木本植物蓖麻［１０］、油棕［１１］、麻疯树［１２］、油茶［１３］、油樟［１４］、油桐［１５］和银杏［１６］中都已经有ＳＡＤ基因克隆和初步功能分析。
对于乌桕，在分子水平上的研究相对甚少，在ＮＣＢＩ中可以检索到的乌桕基因序列总共只有３２条，但乌桕的ＳｓＳＡＤ基因已经被四川大学陈放教授课题组克隆。
乌桕果仁中不饱和脂肪酸含量高达９０％左右的原因以及ＳＡＤ的蛋白表达模式与不饱和脂肪酸积累存在何种关系至今还未见相关报道。
为了搞清楚ＳＡＤ蛋白的表达模式与不饱和脂肪酸积累之间的关系，本实验采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆乌桕ＳｓＳＡＤ基因，构建了该基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达了该蛋白，通过镍柱纯化了该蛋白，本研究结果为乌桕ＳｓＳＡＤ的抗体制备和蛋白表达模式研究奠定了基础。
１ 材料和方法１．１ 实验材料乌桕种子于２０１２年１０月采自湖南怀化；大肠杆菌菌株ＤＨ５α和ＢＬ ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）、原核表达载体均为本实验室保存。
１．２ 实验方法１．２．１ ＳｓＳＡＤ基因的克隆 从ＮＣＢＩ中检索到乌桕ＳｓＳＡＤ基因的ＣＤＳ全长序列，共１ ０９１ｂｐ。
采用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０引物设计软件设计出扩增ＳｓＳＡＤ全长ＣＤＳ的引物序列：Ｆ：５′－ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴ－ＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＣＡ－３′和Ｒ：５′－ＴＧＣＴＣ－ＴＡＧＡ－ＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＴＡＴＣＧＴＡＡＡＴＣ－ＣＡＡＣＴ－３′（下划线序列为酶切位点序列，加粗部分为保护碱基序列），送上海生工生物工程有限公司合成该引物。
用ＲＮＡ提取试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取乌桕种子的总ＲＮＡ，用逆转录试剂盒（Ｔｈｅｒｍｏ）进行逆转录获得ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，１％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
ＰＣＲ反应体系为：５×ＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ ４０．０μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ（含Ｍｇ２＋）８．０μＬ，引物Ｆ和Ｒ各４．０μＬ，５Ｕ／μＬ ＤＮＡ聚合酶Ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ ２．０μＬ，ｃＤＮＡ ２．０μＬ，总体积２００μＬ。
ＰＣＲ产物经胶回收后用ＸｈｏⅠ和ＸｂａⅠ两种酶进行双酶切，同时将ｐＣｏｌｄ载体用ＸｈｏⅠ和ＸｂａⅠ两种酶进行双酶切。
酶切后用磁珠回收试剂盒（ＴＯＹＯＢＯ）纯化，将纯化后得到的ｐＣｏｌｄ和ＰＣＲ产物用Ｔ４ＤＮＡ连接酶４℃连接过夜，将连接产物通过热激的转化方法转化ＤＨ５α感受态细胞，将转化后的细胞加上１ｍＬ ＬＢ培养基在３７℃振荡培养箱中１５０ｒ／ｍｉｎ摇４０ｍｉｎ，６ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ后，倒掉上清，取２００μＬ菌液涂在含１００μｇ／ｍＬ的ＬＢ固体培养基上，３７℃培养过夜。
