下载文档原格式
流式细胞术的基本原理流式细胞术是一种广泛使用的细胞分析技术，可以用于分离、鉴定和计数单个细胞，同时可以对细胞的形态、大小、表面分子、细胞器和细胞活性等方面进行分析。
这项技术已经成为生物医学研究和临床诊断的重要工具之一。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮液通过一根细长的玻璃管，使细胞单个地通过一束激光束，利用光学和电子学技术分析细胞的特性。
这个过程可以分为样本制备、细胞计数和细胞分析三个步骤。
样本制备在进行流式细胞术之前，需要对样品进行一系列的处理，以便得到单个、均匀分布的细胞悬浮液。
样品处理的方法包括细胞分离、细胞培养和细胞染色等。
通常使用的染色剂有荧光素、荧光素同工异构体、荧光素酯和荧光素类核酸探针等。
这些染色剂能够与细胞特定的分子结合，从而标记细胞并使其在流式细胞术中被检测到。
细胞计数细胞计数是流式细胞术的重要步骤之一。
在流式细胞术中，使用一种称为细胞计数器的设备，可以精确地计算细胞的数量。
细胞计数器通常由一个光源、一个流式细胞术仪和一个计算机组成。
在进行细胞计数时，将细胞悬浮液置于流式细胞术仪中，通过一束激光束照射细胞，从而产生荧光信号。
计算机会根据荧光信号的数量和强度来确定细胞的数量。
细胞分析在细胞计数后，可以对细胞进行分析。
流式细胞术中常用的分析方法包括细胞分类、细胞分选和细胞表面分析等。
细胞分类是将细胞根据其形态、大小和荧光特性分为不同的亚群。
细胞分选是将目标细胞从混合的细胞群中分离出来。
细胞表面分析是通过标记细胞表面分子，然后利用流式细胞术检测这些标记物，以确定细胞的特殊表面分子。
总结流式细胞术作为一种高效的细胞分析技术，已经广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
其基本原理是利用激光束对单个细胞进行分析，以确定细胞的特殊特性。
在进行流式细胞术前需要进行样品制备和细胞计数，然后可以对细胞进行分类、分选和表面分析等分析方法。
流式细胞术的应用范围广泛，可以用于癌症诊断、药物筛选和免疫学研究等领域。
流式细胞法原理
流式细胞法原理介绍如下：
流式细胞法是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞法的工作原理是在细胞分子水平上，通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
这种方法利用标记有荧光染料的特异性单克隆抗体对细胞表面的抗原进行染色，使每个细胞都带有特定的荧光信号。
这些荧光信号可以反映出细胞的各种特性，如细胞表面抗原的表达量、细胞大小、颗粒度等。
通过高速流动的液流系统，这些细胞被逐一送入检测区域，被光电倍增管等检测器检测到。
根据这些参数，可以将不同性质的细胞分离开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
此外，流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
通过对这些信号的测量和分析，可以获取细胞的多种参数，进而对细胞进行定性和定量分析。
总的来说，流式细胞法是一种高效、快速、准确的生物学技术，广泛应用于免疫学、肿瘤学、血液学、药理学等领域的研究和临床诊断。
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种高效的细胞分析方法，它可以对单个细胞进行快速、准确的分析。
该技术主要基于细胞在流动状态下通过激光束时所
产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，可以获得有
关细胞形态、大小、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
流式细胞技术基本原理如下：
1. 细胞样品制备：将待检测的细胞样品进行处理，如离心、洗涤等操作，使其达到单个细胞状态，并加入荧光染料或抗体等标记物，以便
在流式仪中进行检测。
2. 细胞在流式仪中流动：将制备好的样品注入到流式仪中，在高速液
体流动中被逐个单独地通过激光束。
3. 激光束照射：当细胞通过激光束时，会发生散射和荧光现象。
散射
现象包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者与细胞大小相关，后者与细胞复杂程度和内部结构相关。
荧光现象则是标记物受激发后
发出的荧光信号，可以用于检测细胞表面标记物或内部结构。
4. 信号检测：流式仪会收集细胞产生的散射和荧光信号，并将其转化
为电信号，通过光电倍增管等装置进行放大和转换。
同时，流式仪还
会记录细胞通过激光束的时间和位置信息。
5. 数据分析：通过对上述收集到的信息进行分析，可以得到有关样品
中细胞数量、大小、形态、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
这些数据可以用于研究细胞生理学、病理学、药理学等领域。
总之，流式细胞技术利用了细胞在流动状态下产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，实现了对单个细胞的快速、准确分析。
该技术在生命科学研究中有着广泛应用，在临床诊断、药物筛选等方
面也有着重要作用。
流式细胞术基本原理与实用技术流式细胞术（Flow Cytometry）是一种常用的细胞分析技术，它基于光学、电子和计算机技术，能够对单个细胞进行快速、准确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞术的基本原理和实用技术。
一、基本原理流式细胞术的基本原理是利用细胞在液体中悬浮的特性，在流动状态下通过一个细胞计数器，同时对细胞进行多参数的检测和分析。
其主要包括以下几个步骤：1. 细胞样品的制备：将待检测的细胞样品进行预处理，如离心、洗涤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞的进样：将细胞悬浮液通过微细管道进入流式细胞仪的流动系统中，形成单细胞的液体流。
3. 细胞的定位和聚焦：利用激光束对细胞进行定位和聚焦，使其逐个通过探测区域。
4. 细胞的激发和发射：通过激光束的照射，激发细胞中的荧光染料或标记物，使其发射特定波长的荧光信号。
5. 光信号的收集和处理：收集细胞发射的荧光信号，并经过光学系统进行分光、分束、分光和聚焦，最后通过光电倍增管或光电二极管转换为电信号。
6. 数据的获取和分析：将电信号转化为数字信号，并通过计算机系统进行数据采集、存储和分析，得到细胞的各项参数及相关统计学分析。
二、实用技术1. 细胞标记技术：为了能够准确地检测和分析细胞的特定性质，常常需要对细胞进行特异性的染色或标记。
常用的标记方法包括荧光染料、抗体标记和基因表达标记等。
2. 多参数分析技术：流式细胞术可以同时检测多个参数，如细胞大小、形态、表面标记物的表达、细胞周期等。
通过合理选择和配置荧光染料和滤光片组合，可以实现多重标记和多参数分析。
3. 数据分析软件：流式细胞术产生的数据量庞大，需要借助计算机软件进行数据的分析和解读。
常用的数据分析软件有FlowJo、CellQuest、ModFit等，它们可以对细胞的分布、比例、相关性等进行统计学分析和图形展示。
4. 高通量流式技术：随着科学研究的深入和技术的发展，高通量流式技术逐渐兴起。
它通过提高仪器的样品处理速度和自动化程度，实现对大量样品的快速检测和分析，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。
通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。
2、流式同型对照怎样选择？同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清）（must be the same species as primary antibody）。
This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。
由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。
举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。
一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。
同型对照：是指与 MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。
主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。
此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。
3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：（1）钙荧光探针负载；（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。
（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。
（4）加入EGTA，20μl（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin 值。
这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。
因为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。
加0.1%triton 是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为最大值。
加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。
4、流式与werstern的区别，知道一些，不足之处请大家补充：（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份，同时都做只加二抗（FITC标记的）的对照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；（4）就个人经验而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。
不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。
当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。
5、FL1， FL2， FL3 的区别是什么? 是指在不同位置测得的荧光?还是不同波长的荧光?这3个参数到底测的是什么?有什么意义?你的理解是正确的，其实FL1， FL2， FL3 是指不同的荧光通道.举个例子来说吧.我们用FITC/PE双标记的细胞，在488nm的激光激发下，这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光，然后这发出的荧光再通过滤光片分开，对应的是不同的波长的滤光片，一般在fl1那的是530nm的滤光片，在FL2那的是575nm的滤光片，这样就可以把在一起的荧光分开了。
6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式细胞术？看你说明书上是怎么说的了，如果没有说就不可以做流式，需要另外买了。
7、MFI和GFI的意义？Geo Mean，叫做几何均数（geometric mean），常用于等级资料和对数正态分布资料，和常用的算数均数（mean）的计算方法不同。
“ %total或者%gate的结果”代表的是百分率，即细胞占总体细胞或者是门内细胞的百分比；用百分比作为统计指标，适用于荧光表达较强的指标。
我看到你的流式图上，检测样本的荧光强度不是很强，属于弱表达的指标，若用百分率统计，就是会失去一部分弱阳性的数据。
我建议可以用平均荧光强度（也就是 mean 值）作为统计指标，比较荧光强度的变化。
8、流式技术中的APC，pure 标记是什么意思呢?荧光物质通常是指那些在受到一个波长激发后，处于一个能量不稳定的状态，能发射一个波长比激发波长长的光的一类物质。
当然荧光并不都是受激发后发射的，如一些生物可以发射荧光，如荧火虫，发光细菌等，他们发出的光是通过体内的酶促反应而产生的，这个酶通常被称为荧光素酶.EB是一种荧光物质，它在受到紫外线照射后可以发出一可见光，常用于DNA、RNA电泳中。
APC英文全名：allophycocyanin；中文名：别藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大发射荧光峰：660nm，适用于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。
PerCP英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻叶绿素蛋白；最大激发波峰490nm，被488nm的氩离子激光激发后，发射光峰值约为677nm，与FITC、PE进行多色荧光染色补偿重叠较少，非特异性结合也较少。
虽然较易使用，但量子产量不高，多用于检测表达较高的抗原。
9、怎样用流式细胞仪来鉴定小鼠BMDC？检测小鼠BMDC主要是从形态学和细胞表面分子两方面来鉴定我做的时候就做了普通光镜下形态、电镜（扫描和透射），另外检测了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86 、CD11、CD80。
还做了MHC II类分子的检测，还有MHCI类分子的检测，这些分子在DC表面都不是特异存在的，在巨噬细胞、淋巴细胞表面也有表达，所以目前并没有非常特异性的方法检测你的细胞一定就是DC，但是从形态和表面分子的检测结合来看，效果就比较好了.一般在幼稚的DC上述分子表达水平较低，DC成熟过程中，上述分子表达呈上调趋势，你可以在不同的培养时间分别检测。
10、请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照？首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对照。
如：你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原，荧光染料为FITC，抗体来源为大鼠的IgG1亚型，即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1），你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC，一般的抗体说明上都会写清。
11、6孔板的细胞量能否做流式呀？对于6孔板而言，每孔的表面积为10 cm2，依细胞种类不同在长满时达到的数量从5*10的5次方到5*10的6次方不等。
6孔板绝对没问题的！甚至24孔板也可以正常做。
不过用于调试仪器参数的正常细胞要多准备一些。
12、血液里的mononuclear cell（除外红细胞，血小板和破碎的细胞碎片），能不能用细胞大小来gating，只看我关心的细胞？（1）红细胞还是小一些，无法100%区分，但还是可用把大部分红细胞gate掉。
（2）溶血也很重要，如果你的红细胞多的话。
（我猜不少，如果用ficol的话）。
可以用氯化铵溶液，如ACK（Lonzo），（3）CD45是所有白细胞都表达的，可以用来区分RBC vs. WBC13、细胞膜蛋白变化是用流氏检测好，还是要做western?膜蛋白的提取，好像很费功夫，提取的不好，western结果也就不可信。
流式需要的抗体很少，流式能够检测阳性表达细胞的比例，western能对总的表达定量，各有有缺点。
14、 FCM检测表达结果到底是用百分比还是MFI。
我作出是单峰，原本我觉得用MFI表示较好。
但我做的2个蛋白很奇怪，一个表达率高，但MFI值低；另一个表达率低，但MFI 值高。
我又作了SYBR GREEN 定量PCR，发现mRNA 的表达基本与百分比相符，而与MFI值不太一致。
个人认为如果有明显阴性细胞群和阳性细胞群，应计算百分比；无明显分群，仅荧光强度发生变化的应该用MFI。
如果是整体峰移（或者叫单峰），那么根本不存在MFI之外的任何合理的指标，不管MFI跟其它指标吻合度如何，这就是客观数据、客观事实。
15、培养细胞的bcl-2及Bax蛋白的检测？首先制成单细胞悬液，PBS洗涤后用胞内染色试剂盒（很多公司都有，其实就是固定剂加增透/打孔剂）进行处理，再进行抗体孵育标记染色，洗涤后上样。
16、流式检测胞内抗原时打孔液的配方？打孔液有很多种，方法也有很多。
与你的实验方法相关。
我用过酒精固定或Triton X-100（我做的都是培养的细胞）：（1）70%的酒精固定24小时即可，不再需要再打孔。
如在PI染色测细胞周期或凋亡。
（2）Triton X-100是比较强烈的穿孔剂。
0.1% Triton X-100/PBS（再加0.1%BSA）是比较温和一点。
浓度可适当提高。
作用时间以几分钟为宜。
这个时间必须要自己试。
时间长了细胞易破裂，短了则打孔不够。
如果你要染胞浆，则时间适当短些，如果要染内质网或核内等，由于要对两层膜性结构打孔，时间当然会长一些（3）可以试试0.1% saponin（皂素）17、标本必须在抗体染色后30分内检测吗？SOP是这么说的：（1）Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C （in the refrigerator） until they are run for flow analysis. The samples should be analyzed within 48 hours. Fluorescence loses its brightness if cells are not kept properly：not at 4 0C， or are exposed to light（2）If cells are not fixed with paraformaldehyde， keep the samples on ice and run them immediately after staining is accomplished因此，如果你没有用PBS洗的话，可以用paraformaldehyde固定，放置48小时。
