胚胎干细胞的研究

格床和实验医学毒志２００９耳３月　弟８卷　弟３期　・９・　

人胚胎生殖干细胞的体外培养研究　

陈明玉（大连铁路卫生学校辽宁大连１１６００１）　

【摘要】　本实验在综合分析目前国内外人胚胎生殖细胞（ＥＧ细胞）的培养条件后，采用组织块培养法，以同源胚胎　的成纤维细胞为饲养层，在不添加任何细胞因子的情况下，对人ＥＧ细胞进行体外培养。该培养体系确保了在培养过程　中人ＥＧ细胞有充足的来源，避免了胰酶以及一些机械操作对原始生殖细胞（ＰＧＣｓ）的损伤，同时也避免了由于用小鼠　成纤维细胞做饲养层，而对培养体系造成的异种蛋白的污染。这是关于建立人ＥＧ细胞合适的体外培养体系的一次有　意义的探索。　【关键词】　干细胞培养体外培养胚胎细胞组织块培养法　

、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．ＣＨＥＮ　，ｌｇ—ｙｕ．Ｄａｌｉａｎ　Ｒａｉｌｗａｙ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｄａｌｉａｎ　Ｌｉａｏｎｉｎｇ　１１６００１，Ｃｈｉｎａ．　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｈｅ　ｄｏｍｅｓｔｉｃ　ｂｙｓｔａｎｄｅｒ　ＥＧ　ｃｅｌｌ　ｒａｉｓｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｕｓｅｓ　ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｂｌｏｃｋ　ｒａｉｓｅ　ｌａｗ　ａｔ　ｐｒｅｓｅｎｔ，ｂｅｃｏｍｅｓ　ｔｈｅ　ｃｉｌｉａｒｙ　ｃｅｌｌ　ｔａｋｅ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｍｂｒｙｏ　ａｓ　ｔｈｅ　ｒａｉｓｉｎｇ　ｌｅｖｅｌ，ａｎｄ　ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ａｎｙ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ，ｅａｒ－　ｔｉｅｓ　ｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒａｉｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＥＧ　ｃｅｌ１．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｇｕａｒａｎｔｅｅｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＥＧ　ｃｅｌｌ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｒｉｇｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｉｓｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ，ｈａｓ　ａｖｏｉｄｅｄ　ｔｈｅ　ｐａｎｃｒｅａｓ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｓｏｍｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＰＧＣｓ　ｄａｍａｇｅ．ｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓｌｙ　ａｖｏｉｄｅｄ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｂｅｃａｍｅ　ｔｈｅ　ｃｉｌｉａｒｙ　ｃｅｌｌ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｔｈｅ　ｒａｉｓｉｎｇ　ｌｅｖｅｌ，ｂｕｔ　ｔｏ　ｒａｉｓｅｄ　ｔｈｅ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ　ｗｈｉｃｈ　ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｒｅａｔｅｄ．Ｔｈｉｓ　ｉｓ　ａｂｏｕｔ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＥＧ　ｃｅｌｌ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒａｉｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｎｅ　ｔｉｍｅ　ｔｏ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｆｇｅｒｍ　ｃｅｌｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ；ＣｅＵｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　

《上海畜牧兽医通讯》２００８年第２期　・５　・　禽类胚胎干细胞的研究进展　采克俊　周国庆　李连茅　张易祥　张念慈　刘　莉　（湖州师范学院生命科学学院浙江湖州　３１３０００）　胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｉｌｓ，ＥＳ细胞）是一种具有　无限增殖能力和全向分化潜能的细胞系，在胚胎发育分化、　组织工程、转基因研究等方面具有重要的应用价值，是目前　生命科学研究的热点之一。禽类产品是人类重要的蛋白质　食物来源，开展禽类的胚胎干细胞研究，并将其用于生产实　践，具有极其重要的意义。禽类ＥＳ细胞研究起步较晚，但进　展较为迅速，许多学者已投入到禽类ＥＳ细胞的研究工作中。　本文就禽类胚胎干细胞的建系、特征与鉴定及转基因操作等　作一综述。　１　ＥＳ细胞的来源　与哺乳动物相比，禽类早期的胚胎发育较为独特。禽卵　在排卵后的１５　ｍｉｎ后在输卵管的漏斗部同精子受精。受精　后的受精卵在输卵管中大约停留２３～２８　ｈ，在此期间，输卵　管膨大部形成的蛋白附着在卵黄上，后在峡部形成内外卵黄　膜，最后在子宫部形成蛋壳，且在这过程中受精卵不断地分　裂，排出体外的受精卵已发育成一个约３～６万个细胞的胚　盘，处于胚胎发育的Ｘ期…。随着胚胎的发育，其中一部分　体细胞分化为原始生殖细胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ，ＰＧＣｓ）。　禽类的ＰＧＣｓ在原肠胚形成期经过相当复杂的迁移，由生殖　新月部位到达生殖嵴。禽类的ＥＳ细胞主要由早期胚胎的胚盘　细胞和原始生殖细胞在体外抑制分化培养而来【２　（见图１）。　１．１胚盘细胞　禽类的胚盘相当于哺乳动物的囊胚，其中的胚盘细胞包　含具有全能性的禽类ＥＳ细胞。Ｐｅｔｉｔｔｅ等最早证实鸡早期胚　盘细胞具有发育的全能性，注射进受体胚胎后，能参与体细　胞和生殖系的嵌合，但并未进行鉴定和体外培养【３］。Ｐａｉｎ等　（１９９６）参照小鼠胚胎干细胞的研究思路，分离的Ⅸ一Ⅺ期胚　盘细胞进行体外抑制分化培养了１６０　ｄ，传至３５代仍具有全　能性，首次获得了禽类的ＥＳ细胞，并获得了两只种系嵌合体　鸡。Ｐａｉｎ等还对鹌鹑的胚盘细胞进行了体外培养研究¨】。　最近，Ｌａｖｏｉｒ等成功地将鸡胚盘细胞体外培养长达９个月之　久【５．。但实际上，目前禽类鸡胚盘细胞体外的长期培养还不　成熟，除以上报道外，其他报道均只对胚盘细胞进行了短期　培养。　１．２原始生殖细胞　禽类的原始生殖细胞起源于上胚层，在孵化的第４期出　现在生殖新月区；在孵化的１０～１２期，出现在血液中，随后　经血液循环大量迁移至生殖嵴处，并在此处定居、增殖，与生　殖嵴一起共同组成了性腺，到孵化的第３０期开始分化¨】。　在不同时期，可分别从这三个部位提取ＰＧＣｓ，用于ＥＳ细胞　建系研究，由此得到的干细胞又称为胚胎生殖细胞（ｅｍｂｒｙ—　ｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ，ＥＧ细胞）。由于禽类的胚胎发育中ＰＣＫ；ｓ数　量较少，常与体细胞混合，在培养前可利用ＰＧＣｓ体积较大的　特点（１５～２５　ｍ）进行Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法纯化。　Ａｌｌｉｏｌｉ等首次从鸡性腺分离ＰＧＣｓ在体外进行了增殖培　养　；随后Ｃｈａｎｇ等将从鸡性腺分离的ＰＧＣｓ在体外培养了　５　ｄ，移植到受体胚胎后可迁移到生殖嵴，并得到了生殖系的　嵌合体鸡，证明培养的ＰＧＣｓ也能够具有发育的全能性　引。　２０００年，Ｐａｒｋ等从５．５　ｄ自来航鸡胚生殖腺分离到Ｐ　ＧＩ　细　胞，连续培养了４个月，细胞传了１０代，首次由ＰＧＣｓ获得禽　类的ＥＧ细胞系【９］。２００２年Ｈａｎ等又将５．５　ｄ自来航鸡胚　ＰＧＣｓ与性腺基质细胞共培养了２个月【１引。值得注意的是，　并非只要ＰＧＣｓ在体外进行了长期培养，就变成了ＥＳ细胞。　Ｖａｎ　ｄｅ　Ｌａｖｏｉｒ等发现将１４～１７期鸡胚血液中的ＰＧＣｓ在体　外培养了２１７　ｄ仍然能保持ＰＧＣｓ的特性，即参与生殖系的　嵌合，而不参与体细胞的嵌合ｕ¨。　ｌ　图１　禽类胚胎干细胞的建系与分化（引自文献Ｌ２　）　２　ＥＳ细胞的体外培养　ＥＳ细胞培养中，一方面要使其无限扩增，另一方面要维　持其未分化状态。然而在胚胎发育过程中，分化和分裂增殖　一般同时并存，因此，必须筛选适宜的培养体系。在禽类胚　胎干细胞的建系中，人们主要就饲养层细胞和培养基进行了　大量的研究。　２．１饲养层鲥胞　选择适当饲养层细胞对ＥＳ细胞的体外培养举足轻重。　饲养层既可分泌各种生长因子抑制ＥＳ细胞的分化，又可促　进ＥＳ细胞的贴附生长。不同来源的饲养层对ＥＳ细胞支持　能力不同。目前禽类ＥＳ细胞培养常用的饲养层有鸡胚成纤　维细胞（ＣＥＦ）、小鼠成纤维细胞株（ＳＴＯ）、小鼠胎儿原代成纤　维细胞株（ＰＭＥＦ）、鸡胚性腺基质细胞等。Ｐｅｔｉｔｔｅ等【２】和　Ｐａｉｎ等【４　在检测不同饲养层对禽类ＥＳ培养的影响时，都发　现每种饲养层不能单独支持胚盘细胞传代培养，当ＣＥＦ饲　养层与条件培养基同时存在时，细胞很快分化为原始成纤维　细胞；而ＳＴＯ饲养层结合条件培养基可支持鸡胚盘细胞传　至２０代以上。由于ＰＭＥＦ或ＣＥＦ饲养层生长能力有限，并　且可能带来病毒支原体的污染，频繁制备饲养层也是一项繁　重的工作。选用ＳＴＯ细胞系作饲养层，培养禽类ＥＳ细胞将　＊为通讯作者。　基金项目：浙江省自然科学基金（Ｙ３０４１９４）。湖州市自然科学资金（２００６ＹＺ０８）。湖州师范学院校级课题（ＫＸ２３Ｏ２７）。　］　～　一　厂。一　１枣　～　Ｉ－．　厂◇～

干细胞研究中的伦理问题

随着干细胞研究的不断深入，相关的伦理问题也越来越受到关注。通俗而言，干细胞就是一种具有自我更新和分化能力的细胞，可以分化为各种不同类型的细胞，包括骨骼肌细胞、神经元、心脏细胞等。因此，在医学领域，干细胞被广泛应用于组织修复、疾病治疗等方面。然而，在开展干细胞研究时，我们也面临着一系列的伦理问题。

1. 胚胎干细胞研究的伦理问题

胚胎干细胞是来源于早期胚胎的细胞，具有广泛的分化能力。因此，在干细胞研究中，胚胎干细胞常被用于体外培养，以期获得更多的干细胞。然而，胚胎干细胞的来源却是极具争议的。在某些情况下，需要通过人工受精、体外受精等方式获得早期胚胎，而这些过程都涉及到人类生命的伦理和道德问题。

此外，在采集胚胎干细胞过程中，常会造成胚胎死亡的风险。这样一来，我们是否应该为了干细胞研究的进展而牺牲未来可能诞生的人类生命呢？这是一个不容忽视的伦理问题。

2. 患者干细胞治疗的伦理问题

近年来，患者自身干细胞治疗备受关注。这种治疗方式就是将患者体内的干细胞提取出来，经过一定的培养和处理后再重新注入到患者体内，以期达到治疗目的。然而，由于干细胞治疗尚处于起步阶段，其疗效和安全性都有待进一步验证。

值得关注的是，干细胞治疗存在着潜在的伦理问题。比如，患者自身干细胞治疗通常需要破坏身体中的部分组织，才能获取足够的干细胞。而这些组织的摘取是否符合伦理和法律的要求呢？同时，干细胞治疗也存在个体差异较大的问题。因此，在进行干细胞治疗时，我们也需要关注患者的权益和目光的可行性。

3. 干细胞应用的道德问题

随着干细胞技术在临床治疗中的应用，我们还需要面对更多的道德和伦理问题。比如，干细胞治疗是否应该纳入医保报销范围？干细胞治疗在商业化和治疗效果的平衡方面是否存在问题？这些都涉及到干细胞治疗的费用和效益评估，也关系到整个社会对干细胞治疗的认识和接受程度。

总的来说，干细胞研究中充满了伦理问题和道德问题。在推进干细胞研究进程的同时，我们也需要关注这些问题，尊重人的生命和权益，探索一种符合伦理要求的干细胞研究道路。如此，才能更好地发挥干细胞在医学和生命科学领域的作用，进而推动人类社会的进步和发展。

胚胎干细胞高三知识点

胚胎干细胞是指存在于早期胚胎的未定向分化的细胞群体，具有自我更新和多向分化潜能的特点。在高三生物课程中，了解胚胎干细胞的基本知识是必不可少的。本文将从胚胎干细胞的来源、特点以及应用等方面进行探讨。

一、 胚胎干细胞的来源

胚胎干细胞可以从早期胚胎中获得，主要包括以下两种来源：

1. 流产胚胎：流产胚胎的内细胞团包含有胚胎干细胞，这些胚胎干细胞可以被提取出来进行研究和应用。

2. 体外受精（试管婴儿）的剩余胚胎：在进行体外受精过程中，通常会产生多个受精卵，而并非所有的受精卵都会被植入母体。剩余的受精卵可以被提取出来，其内细胞团中包含胚胎干细胞。

二、 胚胎干细胞的特点

胚胎干细胞具有以下几个显著特点：

1. 自我更新能力：胚胎干细胞可以通过自我分裂不断产生新的胚胎干细胞，从而实现长期的保存和利用。

2. 多向分化潜能：胚胎干细胞具有分化成为各种细胞类型的潜能，包括神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞等。这使得胚胎干细胞在组织工程和再生医学方面具有广泛的应用前景。

3. 高倍增能力：胚胎干细胞可以在体外进行体外扩增，快速增殖为大量细胞，为后续的实验和应用提供了丰富的细胞资源。

三、 胚胎干细胞的应用

胚胎干细胞的应用在医学领域具有重要意义，主要包括以下几个方面：

1. 组织工程：胚胎干细胞可以分化为各种组织和器官细胞，如心肌细胞、肝细胞等。通过将这些细胞种植到患者体内，可以治疗一些器官损伤和疾病。

2. 病理研究：胚胎干细胞可以用于研究一些疾病的发生和发展机制，从而为病理研究提供新的途径和平台。

3. 药物筛选：利用胚胎干细胞可以进行药物的毒性测试和效果评估，从而提高药物研发过程的效率和准确性。

4. 干细胞治疗：胚胎干细胞可以用于治疗一些无法治愈的疾病，例如某些神经退行性疾病和免疫性疾病等。

5. 生物学研究：胚胎干细胞作为一种特殊的细胞类型，对于生物学研究的进展有着不可或缺的作用，可以更好地理解细胞分化和发育的过程。