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细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。
生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。
细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。
在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。
在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。
实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。
我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。
由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。
编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
细胞融合实验报告
本实验旨在探究细胞融合对细胞生长和功能的影响，为了达到这一目的，我们进行了一系列的实验操作和数据分析。
在实验中，我们选取了两种不同类型的细胞进行融合，并观察了融合细胞的形态特征、生长情况以及功能表现。
首先，我们以显微镜观察了融合细胞的形态特征。
结果显示，融合细胞的形态呈现出明显的异质性，既有细胞A的特征，也有细胞B的特征，这表明细胞融合后细胞的形态会发生明显的改变，产生新的细胞类型。
其次，我们进行了细胞生长曲线的测定。
通过对融合细胞和单一细胞的生长情况进行比较，我们发现融合细胞的生长速度明显快于单一细胞，这说明细胞融合可以促进细胞的生长和增殖。
随后，我们对融合细胞的功能进行了评估。
实验结果显示，融合细胞在某些功能上表现出了明显的增强，例如对外界刺激的响应能力和分泌功能。
这表明细胞融合可以提高细胞的功能表现，使其具有更强的适应能力和生存竞争力。
最后，我们对融合细胞进行了基因表达谱的分析。
结果显示，融合细胞的基因表达谱发生了明显的改变，一些基因的表达水平显著上调或下调，这说明细胞融合会引起基因表达的重新编程，从而影响细胞的功能和特性。
综上所述，本实验结果表明，细胞融合对细胞的形态、生长和功能都产生了明显的影响，这为我们进一步探究细胞融合的机制和应用提供了重要的实验依据。
希望通过我们的努力，能够为细胞融合领域的研究和应用做出更多的贡献。
实验一细胞凝集反应实验目的：1.了解细胞膜表面结构。
2.掌握凝集素促使细胞凝集的原理。
3.学习研究细胞凝集反应的方法。
实验原理：凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。
凝集素使细胞凝集是因为它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。
大多数凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。
凝集素与糖结合的活性及专一性决定其功能。
实验材料及试剂：1.马铃薯块茎2.显微镜、粗天平、载玻片、滴管2支、离心管2支3.PBS缓冲液4.2%的红细胞液实验步骤：1.制备鸡血悬液：取1ml鸡血于离心管中，加食盐水至5ml，用滴管吹打均匀，平衡后放入离心机中，2000r/min来离心5min。
离心完毕后，将上清液倾倒再加食盐水至5ml，2000r/min，离心5分钟。
连续重复5次，最后得到的鸡血细胞再加入食盐水至5ml，即为2%的红细胞悬液。
2.取两个玻片，分别向两玻片上滴加一滴鸡血。
向其中一个鸡血玻片上再滴加一滴土豆凝集素，另一玻片不加，作为对照。
然后同时向两玻片滴加一滴PBS缓冲液，静置5min，观察血细胞的凝集反应。
注意事项：1.注意控制加入双凹片孔中的液体的量，以免双凹片的2个孔中液体混合。
2.样品加到孔中后，摇一下双凹片，并进行计时。
实验二叶绿体的分离与荧光现象实验目的:1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理：将组织匀浆悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞的常用方法。
由于沉降系数和所受到的离心力的不同以及自身性质的不同，可用不同的转速来分离出不同的细胞器。
荧光显微技术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时就能在极端的时间内射出比照射光波长更长的光，这种光称为荧光。
细胞生物学实验教学大纲一、课程的性质、地位和任务细胞生物学是生命科学四大基础学科之一，它从细胞水平、亚细胞水平和分子水平三个不同层次上研究细胞的结构功能和生命活动的基本规律，位于分子生物学与个体生物学之间，同他们互相衔接，互相渗透。
因此，细胞生物学又是一门承上启下的学科。
细胞生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。
同时也使学生具备观察和研究细胞结构与功能的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。
该课程是生命科学相关专业学生的必修课程，也可作为非生命科学专业扩大知识视野的选修课程。
二、教学要求通过实验教学，使学生初步掌握制备植物细胞减数分裂玻片标本的技术和方法，了解石蜡切片的制作过程；初步掌握荧光染色的方法和原理，并熟悉荧光显微镜的使用；掌握细胞电融合方法和化学介导剂诱导细胞融合的原理和方法；了解细胞器的超活染色技术和组织化学技术；了解细胞器分离的一般原理和方法；掌握并熟练地使用各类常用的光学显微镜。
实验教学过程中，要求学生预习实验内容，掌握实验目的及设计思路，了解实验步骤；教师应该认真讲解，细心指导和演示；学生要认真观察实验现象，实事求是地记录实验数据和结果，经过积极的思考后，书写实验报告，报告内容简明扼要，结果翔实，并且分析实验中的一些现象；实验过程中要遵守实验规章制度，爱护实验财产和仪器设备，保持实验室卫生；教师应负责巡视检查实验课的各个环节，认真评阅实验报告，进行实验教学总结。
三、实验考核方式及办法学生对实验课的态度、操作技能和实验报告制作的平时考核及相应期末笔试相结合的综合评分，并以百分制计分。
四、实验学时安排: 24学时五、实验项目一览表实验项目一览表序号实验项目名称实验类型实验要求适用专业课时1 植物细胞的活体染色及观察验证选做理学、农学 42 细胞膜的渗透性验证必做理学、农学 43 叶绿体的分离与荧光观察综合必做理学、农学 44 植物细胞骨架的光学显微镜观察验证必做理学、农学 45 细胞融合综合必做理学、农学 46 DNA的Feulgen染色法和PAS反应法显示多糖综合必做理学、农学 47 膜蛋白质的分离创新选做理学、农学 48 减数分裂中的染色体行为比较设计选作理学、农学 49 电子显微镜技术综合选做理学、农学 410 显微摄影与暗室技术设计必作理学、农学8六、实验项目的具体内容：实验一植物细胞的活体染色及观察1.实验目的和要求1.1掌握植物细胞活体染色的原理和方法。
细胞生物学实验指导实验目录:实验一：特殊显微镜的原理及其使用实验二：电子显微镜的原理及使用实验三：细胞膜的渗透性实验四：细胞的凝集反应实验五：诱导细胞融合—聚乙二醇法实验六：线粒体和液泡系的超活染色与观察实验七：叶绿体的荧光原位观察实验八：细胞骨架的观察实验九：细胞中DNA、RNA的显示实验一特殊显微镜的原理及其使用I.暗视野显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。
二、原理和结构特点在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。
暗视野显微镜就是利用此原理设计的。
它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。
从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。
在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像．并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。
但被检物体为非均质时，并大于1/2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。
一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2μm)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器具有暗视野聚光器的显微镜（二）材料牙垢微生物，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。
（三）试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上一片无划痕、清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。
实验十三细胞融合一、实验目的：两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代。
六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广，不仅名类细胞可以全并，种间远缘细胞也能合并，细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
动物细胞如此。
因此融合细胞的研究成为生物学不论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路，如目前在核质关系，体细胞的遗传与发育，新品种的培养，免疫作用，疾病的治疗和性状的改良。
潜伏病毒的研究等方面上，有的已取得了显著的成绩，有的正在探索之中。
通过实验对体细胞融合有一个清楚概念。
并初步掌握动物细胞合并技术。
二、材料和方法（1）取艾氏腹水瘤细胞。
用注射器剌入接种瘤细胞7—10天的小白鼠腹腔内吸取1或2ml腹水，注放离心管内；加改良的Hank’s液（pH7.4）（缺葡萄糖的Hank’s液，Okaba，1962）以800rpm（转速）离心5分钟，取出上清液，再入改良Hank’s液，搅拌，再同样清洗两次，一次5分钟，一次十分钟，最后再加上适量Hank’s液。
计算每亳升的细胞数量，如与其它细胞合并用，适宜数目一般为107个/ml，即毫升约1000万个细胞。
（2）取鸡血球，在一只公鸡的翼静脉抽取，抽取数量随需要而定，如取5毫升，可用20毫升针筒，先将针与筒用Alsver液润湿，吸入50毫升Alsver 液剌入翼下静脉，吸取5毫升液，注入15毫升Alsver液瓶内，使血液与Alsver 液的比例为1：4。
存入4℃冰箱内务作一星期使用。
作实验时取这种贮备的鸡血球1毫升加入4毫升0。
85%生理盐水以1200—1500rpm离心三次（5分钟、5分钟、10分钟），每次离心后去上清液，加0。
85%生理盐水并搅匀，最末一次离心后，根据沉淀血球量的多少，加入适量0。
85%生理盐水使成1%悬液（0。
1毫升血球加10毫升液体），取1%悬液1毫升加上2毫升或3毫升0。
85%生理盐水或改良Hank’s液，使每一毫升含有血球1500万左右。
细胞融合实验报告【实验题目】动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。
2.学习化学融合的基本操作过程。
3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。
【实验材料与用品】1、材料鸡血红细胞2、试剂50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
3、器材倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。
【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。
1、病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2、化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是广泛使用的化学融合剂。
3、电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验步骤】在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。
具体实验步骤如下：1、取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好，可直接使用】2、取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： 1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml； 1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下离心7min【因时间关系此次实验只离心一次】3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液；4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球xxxx个；5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，2-3min后，显微镜下观察。
