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PLK1靶向治疗在非小细胞肺癌中的研究进展
任凤海
【期刊名称】《实用肿瘤学杂志》
【年(卷),期】2013(027)005
【摘要】世界范围内,非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是癌症死亡的主要原因.随着对NSCLC分子发病机制的深入了解,我们能够发现新的靶点和抗癌药物来治疗NSCLC.Polo样激酶-1(PLK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,并且是有丝分裂的关键性调节因子.PLK1抑制剂能够引起有丝分裂的停止并且引起肿瘤细胞凋亡.PLK1在肿瘤组织中过表达,然而在成熟组织中却很难检测到.RNA干扰(RNAi)是我们抗癌治疗的又一有力工具,它能够靶向mRNA并导致靶基因表达降低.在这篇综述中,我们将重点讨论与NSCLC相关的PLK1、PLK1抑制剂及靶向PLK1 的小干扰RNA(siRNA).
【总页数】4页(P436-439)
【作者】任凤海
【作者单位】哈尔滨医科大学附属肿瘤医院胸外科,哈尔滨,150081
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
【相关文献】
1.非小细胞肺癌表皮生长因子受体靶向治疗中的自噬调控研究进展 [J], 尹东涛;云天洋;刘阳
2.FGFR3-TACC3融合基因在非小细胞肺癌靶向治疗中的研究进展 [J], 田莹莹;刘伟玲;郭永军
3.小分子IGF-1R抑制剂在非小细胞肺癌靶向治疗中的研究进展 [J], 黄佳秀; 孙莹莹; 孙夕林
4.液态活检在非小细胞肺癌靶向治疗中的研究进展 [J], 赵玲;易善永;闫晓倩;郜辉
5.表观遗传机制在非小细胞肺癌靶向治疗获得性耐药中的研究进展 [J], 艾忻;王燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤细胞生物学特性影响骨肉瘤是一种恶性骨肿瘤，最常见于青少年和成年人。
治疗骨肉瘤的主要方法包括手术切除、放疗和化疗，然而目前针对骨肉瘤的治疗效果并不理想。
寻找新的治疗策略是非常迫切的。
siRNA是一种小分子RNA，可以通过特异性沉默靶基因的表达，因此被广泛应用于疾病治疗和研究中。
PLK1是一种重要的细胞周期调控蛋白，已被证实在多种癌症中过度表达，包括骨肉瘤。
本文将讨论siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤细胞生物学特性的影响。
PLK1（Polo-like kinase 1）是一种重要的细胞周期调控蛋白，在有丝分裂期间起到关键作用。
PLK1在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤的增殖、侵袭和抗药性密切相关。
PLK1被认为是肿瘤治疗的一个重要靶点。
siRNA是一种干扰RNA，通过靶向特定基因的mRNA，从而抑制该基因的表达。
siRNA技术被广泛应用于基因沉默和疾病治疗研究中。
目前已有研究表明，siRNA沉默PLK1基因可以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，有望成为肿瘤治疗的新策略。
骨肉瘤是一种常见的骨骼恶性肿瘤，起源于原始骨组织中的成骨细胞、软骨细胞或纤维母细胞等，具有高度侵袭性和转移能力。
目前治疗骨肉瘤的主要方法是手术切除、放疗和化疗，然而这些治疗方法存在局限性，如手术切除后容易复发、放疗和化疗对正常组织细胞毒性较大等。
寻找新的治疗策略对骨肉瘤的治疗至关重要。
siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤细胞生物学特性的影响备受关注。
研究发现，siRNA沉默PLK1基因可以显著抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。
实验结果显示，siRNA沉默PLK1基因能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，降低细胞的侵袭能力。
siRNA 沉默PLK1基因还能够促进骨肉瘤细胞的凋亡，提高细胞的敏感性，降低细胞的抗药性。
siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤的治疗具有潜在的应用价值。
siRNA沉默PLK1基因对骨肉瘤细胞生物学特性的影响机制主要包括以下几个方面：第一，siRNA沉默PLK1基因可以抑制细胞周期的进程。
siRNA 沉默Chk1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响及其作用机制的探讨1442000湖北医药学院附属太和医院肿瘤科2442000湖北医药学院附属太和医院生命科学研究所442000湖北十堰湖北医药学院附属太和医院检验科刘志祥，朱圣明1，李瑞明2，王晓勋2【摘要】目的探讨siRNA 沉默检测点激酶1（Chk1）基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和周期的影响及其作用机制。
方法采用RNAi 技术将乳腺癌细胞MCF-7中Chk1基因沉默，用Western blotting 检测转染前后MCF-7细胞中Chk1蛋白表达情况；采用MTT 比色法和流式细胞术分析Chk1基因沉默对乳腺癌细胞MCF-7增殖和周期的影响。
结果Chk1siRNA 转染后，MCF-7细胞中Chk1蛋白表达下降约82%，明显低于未转染组和脂质体转染组（P ＜0.05）。
Chk1siRNA 转染组转染48h 的MCF-7细胞增殖活性下降，其增殖抑制率为44.7%，明显高于脂质体转染组的5.26%（P ＜0.05）。
流式细胞仪检测显示，Chk1siRNA 转染组G 2/M 期比例为（11.3ʃ0.7）%，明显低于未转染组（44.2ʃ1.9）%和脂质体转染组（45.3ʃ2.1）%，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。
结论siRNA 沉默Chk1基因可明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖，并且其抑制增殖作用与减弱G 2/M 期阻滞有关。
【关键词】MCF-7细胞株；RNA 干扰；细胞周期；检测点激酶1中图分类号：R737.9文献标识码：A文章编号：1009－0460（2012）06－0498－03The effect and mechanism of checkpoint kinase 1siRNA transfection on the proliferation of human mam-mary adenocarcinoma MCF-7cellLIU Zhi-xiang ，ZHU Sheng-ming ，LI Rui-ming ，WANG Xiao-xun．Department of Clinical Laboratory ，Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine ，Shiyan 442000，China【Abstract 】ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of checkpoint kinase 1siRNA transfection on the prolifera-tion of human mammary adenocarcinoma MCF-7cell．Methods The siRNA targeting at Chk1gene was transfected into MCF-7cells．The protein expression of Chk1was detected by Western blotting．Cell viability and cell cycle rates were determined by MTT assay andFCM．ResultsThe Chk1expression at protein levels in Chk1siRNA-transfected group was reduced by about 82%compared with un-transfection and lipofectamine group （P ＜0.05）．The lack of Chk1expression resulted in decreased cellular proliferation activity．The inhibition rate for 48h in Chk1siRNA-transfected group was 44.7%（P ＜0.05），which was higher than that of lipofectamine group （5.26%）．In addition ，the percentage of the Chk1siRNA-transfected cells in G 2/M phase was （11.3ʃ0.7）%，which was lower than （44.2ʃ1.9）%and （45.3ʃ2.1）%in the remaining two groups （P ＜0.05）．ConclusionChk1siRNA obviously decreasesthe Chk1expression in MCF-7cells and cellular proliferation activity relates to the block of cell cycle in G 2/M phase．【Key Words 】MCF-7cell line ；RNAi ；Cell cycle ；Checkpoint kinase 1细胞周期检测点是控制细胞增殖周期的限速位点，是防止因基因组不稳定而造成细胞癌变的关键因素。
文章编号：1000-5404（2012）21-2141-04论著Sphk 1基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响张彦，郑晓东，唐鹏，张毅，姜军（400038重庆，第三军医大学西南医院乳腺中心）［摘要］目的通过抑制鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase-1，Sphk 1）基因表达，观察其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响。
方法使用脂质体2000将化学合成的靶向Sphk 1基因的小干扰RNA （small interfering RNA ，siRNA ）转入人乳腺癌MCF-7细胞。
使用流式细胞术（FCM ）检测转染效率，荧光定量RT-PCR （qRT-PCR ）和Western blot 法检测Sphk 1的mRNA 和蛋白表达水平。
利用CCK-8法检测细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell 小室法检测细胞迁移能力。
结果Sphk 1siRNA 转染效率达89%。
转染siRNA 后，MCF-7细胞的Sphk 1mRNA 和蛋白表达水平均明显下降，以siRNA-2效果最为显著（P ＜0．01）。
转染Sphk 1siRNA-2后，MCF-7细胞的增殖和迁移能力明显下降，凋亡细胞比例增加，以上差异均具有统计学意义（P ＜0．05）。
结论干扰Sphk 1基因表达可有效抑制MCF-7细胞的增殖、迁移能力，同时诱导细胞发生凋亡，Sphk 1基因可能成为一个潜在的乳腺癌治疗靶标。
［关键词］乳腺肿瘤；RNA 干扰；siRNA ；Sphk 1［中图法分类号］R394．2；R730．23；R737．9［文献标志码］A［基金项目］国家自然科学基金（81072156）［通信作者］姜军，电话：（023）68754160，E-mail ：jcbd@medmail．com．cn 张毅，电话：（023）68765779，E-mail ：zy53810@163．com Sphk 1interference suppresses proliferation ，apoptosis and migration in human MCF-7breast cancer cellsZhang Yan ，Zheng Xiaodong ，Tang Peng ，Zhang Yi ，Jiang Jun （Center of Breast Disease ，Southwest Hospital ，Third MilitaryMedical University ，Chongqing ，400038，China ）［Abstract ］Objective To investigate the effect of down-regulating sphingosine kinase-1（Sphk 1）onthe proliferation ，apoptosis and migration in human breast cancer MCF-7cell line．Methods The siRNAagainst Sphk 1was chemically synthesized and then transfected into MCF-7cells using Lipofectamine 2000．Transfection efficiency was examined by flow cytometry （FCM ）and the expression levels of Sphk 1mRNA and protein were determined by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting．Cell proliferation andcell apoptosis was assessed by CCK-8assay and FCM respectively．Cell migration was measured by transwellassay．Results The efficiency of siRNA transfection into human MCF-7cells were 89%．The siRNA againstsphk1gene significantly reduced the mRNA and protein expression of Sphk 1in MCF-7cells （P ＜0．05）．ThesiRNA-2showed most significant effect （P ＜0．01）．The MCF-7cells transfected with Sphk 1siRNA-2showed asignificant decrease of cell proliferation and migration compared to the control cells．Moreover ，significant increase of proportion of apoptotic cells were detected in the transfected cells （P ＜0．05）．Conclusion Sphk 1knockdown in breast cancer cells effectively inhibits the proliferation and migration and induces the apoptosis in MCF-7cells．Sphk 1may become a potential target for gene therapy of breast cancer．［Key words ］breast cancer ；RNA interference ；siRNA ；Sphk 1Supported by the National Natural Science Foundation of China （81072156）．Corresponding author ：Jiang Jun ，Tel ：86-23-68754160，E-mail ：jcbd@medmail．com．cn ；Zhang Yi ，Tel ：86-23-68765779，E-mail ：zy53810@163．com乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一。
RNAi沉默MACC1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的实验研究的开题报告
一、研究背景
乳腺癌是世界范围内女性患癌的主要原因之一，特别是在发达国家。
虽然乳腺癌的治疗不断进步，但抗癌药物的限制性较大，因此寻找抗癌
的新途径和新靶点就显得尤为重要。
MET，是一种胞外区域受到肝素依赖的生长因子受体，通过激活其
内在的酪氨酸激酶，可引导肿瘤细胞的迁移、转移、侵袭和血管生成等
生物学功能，MET靶向药物已经用于胃癌和肺癌的治疗。
MACC1是MET 的转录因子，参与促进癌细胞的侵袭、转移和肿瘤血管生成，被视为一
种可能的抗肿瘤治疗治标靶点。
因此，RNA干扰技术可用于探索MACC1在乳腺癌中的潜在作用。
二、研究目的
本研究旨在使用RNA干扰技术，沉默乳腺癌MCF-7细胞的MACC1
基因表达，探究MACC1对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响，了解乳腺癌发生和发展的潜在机制。
三、研究方法
1.构建RNA干扰载体，沉默MCF-7细胞中的MACC1基因。
2.使用Western blot分析法和RT-PCR检测法检测MCF-7细胞MACC1基因表达水平。
3.使用MTT法检测细胞增殖，Transwell迁移法和划痕愈合实验检测细胞迁移能力。
4.采用RNA-Seq技术，通过对对比组的分析研究MACC1沉默MCF-
7细胞的基因表达变化及其调控的机制。
四、研究意义
本研究通过沉默MCF-7细胞MACC1基因表达，探究其在乳腺癌中
的作用机制，并从基因水平揭示MACC1在肿瘤细胞增殖和迁移中的作用，旨在为发现新的治疗靶点和药物提供理论依据和实验支持，有助于提高
乳腺癌的治疗有效性和生存率。
SiRNA沉默PGC-1α表达对子宫内膜癌细胞生长及
凋亡的影响的开题报告
题目：SiRNA沉默PGC-1α表达对子宫内膜癌细胞生长及凋亡的影响
背景：PGC-1α是一种重要的转录共激活因子，是细胞代谢和能量平衡的关键调节因子。
研究表明，PGC-1α在肿瘤细胞中表达水平明显上调，可能与癌细胞生长、分化及耐药性等方面有关。
而子宫内膜癌是女性生
殖系统最常见的恶性肿瘤之一，因此探究SiRNA沉默PGC-1α表达对子宫内膜癌细胞生长及凋亡的影响对于深入理解其发病机制、寻找新的治疗
方法具有重要的意义。
目的：本研究旨在探究SiRNA沉默PGC-1α表达对子宫内膜癌细胞生长及凋亡的影响，为深入理解其发病机制、寻找新的治疗方法提供实验
依据。
方法：选取子宫内膜癌细胞株作为实验对象，利用SiRNA技术沉默PGC-1α基因表达，采用MTT法检测细胞生长情况，利用流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡情况。
同时，利用Western blot分析PGC-1α、CyclinD1、Bcl-2、Bax及Cleaved-caspase-3等相关蛋白表达水平。
预期结果：SiRNA沉默PGC-1α基因表达可有效抑制子宫内膜癌细胞生长，诱导其凋亡。
同时，SiRNA沉默PGC-1α基因表达可能通过抑制CyclinD1、Bcl-2的表达、促进Bax及Cleaved-caspase-3的表达等机制
实现对子宫内膜癌细胞的生长及凋亡的调控。
意义：本研究的结果将有助于深入了解子宫内膜癌的发病机制及治
疗靶点的寻找，为临床治疗提供新的思路和方法。
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2021.05.001㊃基础免疫学㊃siRNA 沉默SCD1基因对MCF⁃7细胞增殖㊁凋亡及脂质代谢的影响①黄慧敏 杨 勇② 魏 英 王靳琎 陈琴华③ (湖北医药学院附属东风医院实验中心,十堰442008) 中图分类号 R734.1 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2021)05⁃0513⁃06①本文受国家自然科学基金(81872509);十堰市科学技术研究与开发项目(18Y78)资助㊂②湖北医药学院附属东风医院结直肠肛门外科,十堰442008㊂③武当特色中药研究湖北省重点实验室,十堰442008㊂作者简介:黄慧敏,女,硕士,主管药师,主要从事肿瘤药理学方面的研究,E⁃mail:1330526136@㊂通信作者及指导教师:陈琴华,男,博士,主任药师,主要从事药物分析学方面的研究,E⁃mail:1472355055@㊂[摘 要] 目的:通过小干扰RNA(siRNA)干扰技术研究SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞增殖㊁凋亡和脂质代谢的影响㊂方法:以脂质体lipofectamine2000包裹siRNA 的方法沉默SCD1基因,RT⁃PCR 检测SCD1mRNA 相对表达量;Western blot 法检测SCD1蛋白表达量;MTT 法检测转染MCF⁃7细胞增殖活性改变;Annexin V⁃FITC /PI 染色检测MCF⁃7细胞凋亡情况;ELISA 检测MCF⁃7细胞胆固醇和三酰甘油生成水平㊂结果:SCD1⁃siRNA 转染MCF⁃7细胞后,可显著抑制SCD1mRNA 和蛋白表达;MTT 实验显示,转染SCD1⁃siRNA 后MCF⁃7细胞增殖能力显著减弱;Annexin V⁃FITC /PI 染色显示,沉默SCD1基因能显著增加MCF⁃7细胞凋亡;SCD1⁃siRNA 转染后MCF⁃7细胞内胆固醇㊁三酰甘油水平均明显降低,与NC⁃siRNA 组相比差异均有统计学意义㊂结论:通过siRNA 干扰技术沉默SCD1基因可明显降低MCF⁃7细胞脂质代谢水平,抑制其增殖并诱导凋亡㊂[关键词] 硬脂酰辅酶A 去饱和酶1;MCF⁃7细胞;脂质代谢;细胞增殖;细胞凋亡Effect of siRNA⁃mediated SCD1gene silencing on proliferation ,apoptosis and lipid metabolism of MCF⁃7cellsHUANG Hui⁃Min ,YANG Yong ,WEI Ying ,WANG Jin⁃Jin ,CHEN Qin⁃Hua .Department of Experiment Center ,Affiliated Dongfeng Hospital ,Hubei University of Medicine ,Shiyan 442008,China[Abstract ] Objective :To investigate the effect of stearoyl⁃Coenzyme A desaturase1(SCD1)gene silencing on theproliferation,apoptosis and lipid metabolism of MCF⁃7cells by siRNA interference technology.Methods :Silencing the SCD1gene by encapsulating siRNA with liposome lipofectamine2000.RT⁃PCR and Western blot were used to detect the efficiency of SCD1silencing in mRNA and protein levels.The proliferation ability and apoptosis of MCF⁃7cells were tested by MTT assay and Annexin V⁃FITC /PI staining.The cholesterols and triglycerides levels in MCF⁃7cells were detected by ELISA.Results :SCD1⁃siRNA transfected MCF⁃7cells could remarkably decreased the expression levels of SCD1mRNA and protein.MTT and flow cytometry assay showed that the pro⁃liferation ability was obviously inhibited and cell apoptosis was increased in SCD1⁃siRNA group.The cholesterols and triglycerides levelsin MCF⁃7cells were significantly lower compared with NC⁃siRNA group.Conclusion :Silencing SCD1gene by siRNA interference couldsignificantly reduce lipid metabolism of MCF⁃7cells,inhibit its proliferation and induce apoptosis.[Key words ] Stearoyl⁃Coenzyme A desaturase1;MCF⁃7cell;Lipid metabolism;Cell proliferation;Cell apoptosis 女性乳腺癌发病率占全球女性恶性肿瘤的30%,死亡率占女性恶性肿瘤的15%,且发病率呈逐年上升趋势[1]㊂因此,进一步研究乳腺癌的有效治疗方法具有重要的意义㊂近年来,脂质代谢紊乱作为乳腺癌的危险因素,受到国内外学者的关注㊂硬脂酰辅酶A 去饱和酶1(stearoyl⁃coenzyme A desaturase 1,SCD1)是脂肪酸从头合成的关键酶,广泛参与脂肪代谢,进而影响细胞膜结构及信号传导等生物学功能,与细胞增殖㊁凋亡及炎症反应等关系密切[2⁃3]㊂研究显示SCD1的表达与乳腺癌的发生㊁发展及预后呈负相关[4⁃7]㊂本研究拟通过小干扰RNA (small interfreing RNA,siRNA)干扰技术阻断乳腺癌MCF⁃7细胞中SCD1表达,通过MTT 增殖实验㊁Annexin V⁃FITC /PI 染色㊁ELISA 等实验,检测SCD1基因沉默后对MCF⁃7细胞增殖㊁凋亡及脂质代谢的影响,以期为深入研究SCD1基因在乳腺癌MCF⁃7细胞中的作用及靶向治疗药物开发提供实验依据㊂1 材料与方法1.1 材料 人乳腺癌MCF⁃7细胞购自中国科学院细胞库;TRIzol Reagent购自美国Omega公司;反转录试剂盒购自美国Fermentas公司;PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;SCD1抗体购自美国Abcam公司;荧光二抗购自优宁维公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen 公司;Annexin V⁃FITC/PI凋亡试剂盒购自美国Sigma公司;MTT购自南京凯基生物有限公司;胆固醇及三酰甘油试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司;全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司;BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;DMEM培养基购自美国Gibco公司; PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司合成,引物序列见表1;SCD1特异性siRNA干扰序列(SCD1⁃siRNA)和siRNA阴性对照序列(NC⁃siRNA)由上海吉玛制药技术有限公司合成,siRNA寡核苷酸序列见表2㊂1.2 方法1.2.1 细胞来源及其培养 人乳腺癌MCF⁃7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液,在5%CO2㊁37℃条件下培养,当细胞密度达到80%~90%时消化传代,进行各项实验㊂1.2.2 细胞转染 实验分成3组:SCD1⁃siRNA组㊁NC⁃siRNA组㊁Control组㊂SCD1⁃siRNA组转染75nmol/L的SCD1⁃siRNA,NC⁃siRNA组转染等浓度表1 RT⁃PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT⁃PCRGenes Primer sequences(5′-3′)SCD1F:TCTAGCTCCTATACCACCACCAR:TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC GAPDH F:CTTTGACGCTGGGGCTGGCAR:TGGCAGGGACTCCCCAGCAG表2 siRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of siRNAGenes Sequeces(5′-3′)SCD1⁃siRNA F:GGUACUACAAACCUGGCUUTTSCD1⁃siRNA R:AAGCCAGGUUUGUAGUACCTTNC⁃siRNA F:UUCUCCGAACGUGUCACGUTTNC⁃siRNA R:ACGUGACACGUUCGGAGAATT 的NC⁃siRNA,Control组加入等体积转染试剂,每组设5个复孔㊂转染前1d,取对数生长期MCF⁃7细胞铺于6孔板,转染前观察细胞生长状态,密度达60%~80%时,按照Lipofectamine2000转染试剂说明书及siRNA说明书进行细胞转染㊂1.2.3 荧光显微镜观察siRNA转染效率 转染前1d,将约1.0×105个MCF⁃7细胞种于24孔板,当细胞密度达70%时,给予FAM标记的siRNA进行转染,转染24h后PBS洗涤2次,倒置荧光显微镜下观察并摄片㊂荧光显微镜摄片时,激发光为蓝光,激发波长480nm,各组细胞摄片条件均一致㊂1.2.4 RT⁃PCR法检测SCD1mRNA表达 按照1.2.2转染MCF⁃7细胞,48h后收集细胞,TRIzol试剂提取总RNA,逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,RT⁃PCR检测SCD1的mRNA表达水平,以GAPDH为内参进行目的基因表达的相对定量分析,引物序列见表1㊂反应程序为:95℃预变性10min; 95℃变性15s;62℃反应40s,40个循环,以2-ΔΔCt值表示待测基因mRNA的表达水平㊂实验重复3次㊂1.2.5 Western blot法检测SCD1蛋白的表达 按照1.2.2转染MCF⁃7细胞,48h后收集细胞,加RIPA裂解液提取细胞内总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,GAPDH为内参㊂取等量蛋白进行电泳并转膜后,5%脱脂奶粉室温封闭1h,分别加入1∶1000稀释的SCD1抗体和GAPDH抗体,4℃过夜,加入相应1∶10000稀释的二抗,室温孵育1h㊂ECL发光, UVP凝胶成像系统显影,Image J软件分析目标蛋白的光密度值㊂1.2.6 MTT检测细胞增殖活性 按照1.2.2转染MCF⁃7细胞,48h后消化细胞并计数,5×103个/孔接种于96孔板,每组设5个复孔㊂24h后每孔加入5mg/ml的MTT工作液20μl,5%CO2㊁37℃继续培养4h,弃去培养基,每孔加DMSO150μl,低速振荡10min,酶标仪490nm波长下测每孔OD值,实验重复3次㊂1.2.7 Annexin V⁃FITC/PI染色检测细胞凋亡 ①按照1.2.2转染MCF⁃7细胞,48h后弃上清,PBS 清洗3遍,每孔加入1×Binding Buffer工作液500μl,并加Annexin V⁃FITC5μl,3min后再加入PI10μl,轻轻混匀,室温避光孵育10min,荧光显微镜观察细胞凋亡情况㊂②转染MCF⁃7细胞48h后用不含EDTA㊃2Na的0.25%胰酶消化并收集细胞至离心管,用4℃预冷的PBS洗涤2次,每孔收集的细胞数不少于1×106个,各离心管中加入1×Binding Buffer250μl重悬细胞,细胞悬液中加入Annexin V⁃FITC 5μl,轻轻混匀后间隔3min,再加入PI 10μl,室温避光孵育10min,各反应管中加入PBS 300μl,再次混匀后于488nm 的流式细胞仪上进行检测㊂1.2.8 细胞胆固醇及三酰甘油水平检测 按照1.2.2转染MCF⁃7细胞,48h 后收集沉淀,PBS 清洗3遍,全蛋白提取试剂提取细胞总蛋白,BCA 试剂盒检测总蛋白浓度㊂细胞内胆固醇及三酰甘油水平按照试剂盒操作说明书测定,并以总蛋白浓度为标准进行校正,酶标仪550nm 波长下检测样本OD 值㊂每组设5个复孔,实验重复3次㊂1.3 统计学处理 数据分析及作图均采用GraphPad Prism 8软件㊂计量数据符合正态分布及方差齐性,以x ±s 表示,三组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett⁃t 检测,P <0.05为差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 Lipofectamine2000介导FAM 标记的siRNA 转染效率测定 不同浓度(0㊁25㊁50㊁75nmol /L)FAM 标记的siRNA 转染MCF⁃7细胞,24h 后观察转染率㊂结果见图1,当siRNA 浓度为0nmol /L 时,MCF⁃7细胞无荧光当siRNA 浓度为25nmol /L 时,出现荧光,随着siRNA 浓度的增加,荧光强度逐渐增强,当siRNA 浓度为75nmol /L 时,荧光强度最强,80%以上MCF⁃7细胞发绿色荧光,表明有较多siRNA 被转染入细胞,故后续实验中所用siRNA 浓度均为75nmol /L㊂2.2 RT⁃PCR 法检测siRNA 沉默SCD1基因的效率图1 荧光显微镜观察不同浓度FAM 标记的siRNA 转染效果Fig.1 Transfection efficiency of different concentrationsof FAM⁃siRNA observed by fluorescence micro⁃scope 如图2所示,NC⁃siRNA 转染组中SCD1基因的mRNA 表达量为0.971±0.043,与Control 组(1.0±0.029)相比差异无统计学意义(P >0.05);而SCD1⁃siRNA 转染组中SCD1基因的mRNA 表达量为0.357±0.026,与NC⁃siRNA 转染组(0.971±0.043)相比显著降低(P <0.001)㊂结果提示转染SCD1⁃siRNA 后MCF⁃7细胞中SCD1mRNA 表达被有效抑制㊂2.3 Western blot 法检测SCD1基因沉默对SCD1蛋白表达的影响 如图3所示,SCD1⁃siRNA 转染组SCD1蛋白表达水平显著低于NC⁃siRNA 转染组和Control 组(P <0.001),NC⁃siRNA 转染组和Control 组相比差异无统计学意义(P >0.05)㊂表明SCD1⁃siRNA 干扰可有效抑制SCD1蛋白表达㊂2.4 MTT 法检测SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞增殖的影响 如图4所示,Control 组MCF⁃7细胞增殖率为(100.00±2.943)%,NC⁃siRNA 转染组和SCD1⁃siRNA 转染组细胞增殖率分别为(98.54±2.365)%和(82.25±2.112)%㊂NC⁃siRNA 转染组的细胞增殖率和Control 组差异无统计学意义(P >0.05),SCD1⁃图2 SCD1⁃siRNA 转染对MCF⁃7细胞SCD1mRNA 表达的影响Fig.2 Effect of SCD1⁃siRNA transfection on expression ofSCD1mRNA in MCF⁃7cellsNote:***.P <0.001vs NC⁃siRNAgroup.图3 SCD1⁃siRNA 转染对MCF⁃7细胞中SCD1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of SCD1⁃siRNA transfection on expression ofSCD1protein in MCF⁃7cellsNote:***.P <0.001vs NC⁃siRNA group.siRNA 转染组细胞增殖率显著低于NC⁃siRNA 转染组(P <0.01)㊂表明SCD1基因表达下调后,MCF⁃7细胞增殖能力受到明显抑制㊂2.5 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞凋亡的影响 如图5A 所示,Annexin V⁃FITC 将早期凋亡细胞染成绿色,PI 可将晚期凋亡细胞的细胞核染成红色㊂荧光显微镜下,Control 组及NC⁃siRNA 转染组凋亡细胞较少,SCD1⁃siRNA 转染组凋亡细胞数明显增多,且早期凋亡细胞多于晚期凋亡细胞㊂流式细胞凋亡图中,凋亡细胞为早期凋亡细胞数(Q3)与晚期凋亡细胞数(Q2)之和㊂如图5B 所示,Control 组㊁NC⁃siRNA 转染组和SCD1⁃siRNA转染组细胞凋亡率分图4 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞增殖的影响Fig.4 Effect of SCD1gene silencing on proliferation ofMCF⁃7cellsNote:**.P <0.01vs NC⁃siRNAgroup.图5 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of SCD1gene silencing on apoptosis of MCF⁃7cellsNote:***.P <0.001vs NC⁃siRNA group.别为:(5.76±0.438)%㊁(7.74±0.467)%和(25.96±1.896)%㊂NC⁃siRNA 转染组细胞凋亡率与Control 组差异无统计学意义(P >0.05),SCD1⁃siRNA 转染组细胞凋亡率显著上升,与NC⁃siRNA 转染组相比具有统计学意义(P <0.001)㊂提示沉默SCD1基因可促进MCF⁃7细胞凋亡㊂2.6 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞内胆固醇含量的影响 如图6所示,Control 组㊁NC⁃siRNA 转染组㊁SCD1⁃siRNA 转染组细胞内胆固醇水平分别为:(51.10±4.178)nmol /mg㊁(48.10±3.229)nmol /mg㊁(31.29±4.510)nmol /mg㊂NC⁃siRNA 转染组与Control 组细胞内胆固醇水平,差异无统计学意义(P >0.05);SCD1⁃siRNA 转染组细胞内胆固醇水平较NC⁃siRNA 转染组显著降低(P <0.01)㊂表明沉默SCD1基因可抑制MCF⁃7细胞内胆固醇合成㊂2.7 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞内三酰甘油含量的影响 如图7所示,Control 组㊁NC⁃siRNA转染图6 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞内胆固醇含量的影响Fig.6 Effect of SCD1gene silencing on cholesterol level inMCF⁃7cellsNote:**.P <0.01vs NC⁃siRNAgroup.图7 SCD1基因沉默对MCF⁃7细胞内三酰甘油含量的影响Fig.7 Effect of SCD1gene silencing on triglyceride levelin MCF⁃7cellsNote:*.P <0.05vs NC⁃siRNA group.组㊁SCD1⁃siRNA转染组细胞内三酰甘油水平分别为:(61.21±8.949)nmol/mg㊁(58.66±9.132)nmol/mg㊁(42.49±3.707)nmol/mg㊂NC⁃siRNA转染组与Control组细胞内三酰甘油水平差异无统计学意义(P>0.05);SCD1⁃siRNA转染组细胞内三酰甘油水平较NC⁃siRNA转染组显著降低(P<0.05)㊂表明沉默SCD1基因可抑制MCF⁃7细胞内三酰甘油合成㊂3摇讨论RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是调控基因表达㊁功能基因组学研究的重要方法,siRNA 是RNAi过程中的重要产物,具有高度特异性及级联放大效应等特点,可在转录水平后诱导基因沉默㊂近年siRNA高效并特异性阻断了多种肿瘤细胞中靶基因的表达,抑制了肿瘤细胞增殖和侵袭,诱导了肿瘤细胞凋亡,目前已成为研究肿瘤基因靶向治疗的重要工具[8⁃9]㊂乳腺癌是全球女性发病率最高的肿瘤之一㊂研究显示,机体脂质代谢与乳腺癌的发生发展密切相关,肥胖既是乳腺癌发病的高危因素,同时影响其预后[10]㊂SCD1是催化饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的限速酶,与脂质代谢紊乱关系密切,在结肠癌㊁肺癌㊁肾癌㊁肝癌等多种癌细胞及肿瘤组织中异常表达㊂MASON等[11]研究发现,降低结肠癌HCT116细胞中SCD1表达,可阻断脂肪酸的合成从而诱发细胞凋亡;HESS等[12]研究发现抑制肺癌H460细胞中SCD1的表达,可阻断细胞周期进展,诱导细胞程序性死亡从而抑制H460肺癌细胞增殖;VON ROEMELING等[13]发现在肾透明细胞癌组织中SCD1基因呈高表达,同时体内㊁体外实验均表明SCD1缺陷可诱导细胞凋亡,阻断细胞生长,并促进内质网应激反应;BANSAL等[14]研究发现,SCD1在HepG2等多种肝癌细胞及肝癌组织中高表达,抑制SCD1可显著提高HepG2细胞对化疗药物的敏感性并抑制肝癌细胞增殖㊂以上研究表明SCD1是癌症治疗的潜在靶点㊂研究SCD1在乳腺癌中的作用可为乳腺癌治疗提供新的思路㊂本研究通过RNAi技术干扰SCD1在人乳腺癌MCF⁃7细胞中的表达㊂RT⁃PCR及Western blot结果显示,经SCD1⁃siRNA转染后, SCD1mRNA及蛋白表达显著降低,提示MCF⁃7细胞中SCD1的表达得到有效抑制㊂细胞的异常生长与增殖是恶性肿瘤最基本的生物学特征之一,本研究MTT细胞增殖实验显示,SCD1⁃siRNA转染组的细胞增殖率显著低于NC⁃siRNA转染组,即SCD1基因表达下调后,MCF⁃7细胞的增殖能力受到显著抑制㊂细胞凋亡能力降低是肿瘤细胞和正常细胞的重要区别,本研究进一步通过流式细胞术观察了SCD1沉默对MCF⁃7细胞凋亡的影响,结果显示SCD1表达抑制后,MCF⁃7细胞凋亡率显著较高,本研究从反面验证了SCD1具有促进乳腺癌发展的作用㊂赵静[15]研究发现SCD1抑制剂MF⁃438干预MCF⁃7细胞48h,可显著抑制细胞增殖,并诱导MCF⁃7细胞凋亡,与本研究结果一致㊂细胞增殖失控和能量代谢异常与肿瘤的发生发展密切相关,温伯格效应与脂肪酸合成增加是肿瘤细胞2个标志性代谢改变[16⁃17]㊂脂类作为人体三大营养物质之一,具有储存和供应能量㊁参与信号转导㊁构成血浆脂蛋白㊁维持细胞膜结构等重要的生理功能㊂和正常细胞相比,肿瘤细胞持续分裂增殖的能力显著提高,因此需要合成大量的脂质用于新细胞膜和促癌脂质信号分子的合成,并为肿瘤细胞提供能量支持,因此在肿瘤细胞中脂质从头合成途径被高度激活[18⁃20]㊂本实验沉默SCD1基因后,MCF⁃7细胞内胆固醇和三酰甘油水平显著低于NC⁃siRNA转染组㊂黄光明等[21]研究发现,抑制SCD1表达可明显降低肝癌SMMC⁃7721细胞中胆固醇和三酰甘油水平,曹白鸽等[22]研究发现,SCD1过表达后HepG2细胞内脂滴及三酰甘油合成明显增加,下调SCD1表达细胞内脂滴及三酰甘油合成明显减少㊂以上研究结合本实验结果表明,SCD1在癌细胞脂质合成过程中发挥重要作用㊂综上所述,SCD1是MCF⁃7细胞中脂质代谢的关键基因,沉默SCD1可显著抑制MCF⁃7细胞内脂质代谢水平及细胞增殖,并诱导MCF⁃7细胞凋亡㊂本研究为乳腺癌的靶向治疗和新药研发提供了新的思路和方法,SCD1抑制剂作为乳腺癌治疗的新药值得进一步研究㊂参考文献:[1] HUERTA R M,MAYA N G,PÉREZ⁃SOLIS M A,et al.Treatmentof breast cancer with gonadotropin⁃releasing hormone 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[6] LI W,BAI H,LIU S,et al.Targeting stearoyl⁃CoA desaturase1torepress endometrial cancer progression[J].Oncotarget,2018,9(15):12064⁃12078.DOI:10.18632/oncotarget.24304. 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恒河猴 P21基因在 COS－7细胞中沉默位点的验证李雨函;苏静芬;张晨;石亮;刘云波【摘要】Objective To screen the effective silencing targets of P21 gene at the cellular level in rhesus monkey . Methods To detect the expression ofP21 gene in COS-7 cells ( derived from the kidney of African green monkey , Cerco-pithecus aethiops).Four small hairpin RNA (shRNA) sequences targeting rhesus monkey P21 gene were designed and in-serted into lentivirus-based gene silencing constructs FUGW-TDT.The vectors were transfected into COS-7 cells respective-ly.The suppression ofP21 mRNA was detected by real-time PCR, and the expression of P21 protein was detected by West-ern blot assay .Results Four gene-silencing sequences were screened that lied in 541-561 bp, 542-562 bp, 215-239 bp, and 624-648 bp of the rhesus monkey P21 mRNA.Their silencing rate was (91.82 ±3.21)%, (82.47 ±2.48)%, (81.31 ±2.69 )% and ( 87.35 ±4.59 )%, and the protein expression was ( 11.97 ±0.70 )%, ( 20.22 ±0.65 )%, ( 23.21 ±0.63)%and (14.42 ±0.86)%, respectively.Conclusions Four effec tive silencing target sequences are screened at cel-lular level , which can be used in gene silencing research of rhesus monkeys .%目的：在细胞水平筛选恒河猴 P21基因的有效沉默靶点。
siRNA 沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响王涛;韩娜【摘要】Objective To investigate the effects of siRNA silencing of inhibitor of apoptosis protein gene on the proliferation of airway smooth muscle in bronchial asthma mice .Methods Tweenty female BALB/c mice were randomly divided into experimen‐tal group and control group .Mice in the experimental group were constructed asthma models .The trachea and bronchi were collect‐ed for cell culture .Respectively ,the cultured airway smooth muscle cells in the experimental group and the control group were grouped:PBS control group (added to PBS solution) ,missense chain control group (transfected with missense chain) and siRNA transfection group (transfected with siRNA Survivin) .The expressions of Survivin mRNA ,Survivin pr otein and caspase‐9 protein in airway smooth muscle cells were detected .The levels of IL‐6 and CCL5 in cell supernatant were detected .Results RT‐PCR re‐sults showed that ,the relative expression levels of Survivin RNA of airway smooth muscle cells in the siRNA transfection group of the experimental group were lower than the PBS control group and missense chain group ,the differences were statistically signifi‐cant (P<0 .05) .Western blot results showed that ,the expressions of Survivin proteins in the siR NA transfection group of the ex‐perimental group were lower than the PBS control group and missense chain control group ,while the caspase‐9 protein were higher , In the experimentalgroup ,the synthesis and secretion levels of IL‐6 and CCL5 of airwaysmoo th muscle cells in the siRNA transfec‐tion group were lower than the PBS control group and missense chain control group ,the cell proliferations at 2-4 d in the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group ,the proportion of G0/G1 phase in the siRNA transfection group were higher than the PBS control group and missense chain control group ,but the proportion of S/G2 phase were lower than the PBS control group and missense chain control group ,cells apoptosis rates of the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group ,the differences were statistically significant (P<0 .05) .Conclusion siRNA specific silencing Survivin gene could accelerate the airway smooth muscle cellapoptosis ,and inhibit cell abnormal proliferation and secretion .%目的：探讨 siRN A 沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响。
