(优选)实验动物肝脏提取

（优选）实验动物肝脏提取
（一）动物肝脏DNA制备原理
要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： ➢ 如何选材，如何破碎组织细胞？ ➢ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核
蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除 去蛋白质。)
➢ 设法除去RNA的污染； ➢ 防止DNA酶的降解作用；
超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细胞器。使用时注意降温，防止过热。
冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放 入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分 细胞可以被破碎。
有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶 剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处 理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂， 此法也可以与研磨法联合使用。
激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸 收260nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收 302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终 激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究 中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相 对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察 到的电泳结果：
* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB： 即 3 , 8 - 二 氨 基 -5 - 乙 基 - 6 - 苯 基 菲锭 溴 盐 (Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧 光。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电 场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关 外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶 的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的 确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的 两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的 激发下发出橙黄色的荧光。
压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使 几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细 胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器 费用较高。
细胞破碎方法—机械物理法
反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－ 20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引 起细胞溶胀破碎。
利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋 白分离开来。
➢ 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性， 然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相 及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95 ％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
➢ 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可 以直接从生物材料中提取DNA。
➢ 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入 适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸， 以降低DNA酶的活性。
➢ 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的 DNA。
➢ 保 存 ： 将 DNA 于 滤 纸 上 干 燥 ， 溶 于 1mlTE中低温保存。
（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种 电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方 法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方 法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由 半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼 脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的 凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比 琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳
分离。
琼脂糖浓度
/%
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2 1.5
2.0
线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-
0.2 2-0.1
琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度 快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电 泳。 （2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率 高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外 光检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制 成干膜可长期保存。
要提取动物组织DNA，一般选择 细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏 器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。
细胞破碎方法—机械物理法：
研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少 量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合 实验室使用。
组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热 和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒， 可反复多次。
荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光， 并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm 和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发 出波长为590nm的红橙色荧光。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶 放在含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至 更少的DNA。
溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液 和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差， 溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出 细胞内含物。
ห้องสมุดไป่ตู้
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中
溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很
低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较，便可测出未知片段的大小。
（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环 状DNA.