人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达作者：伊正君，朱道银，李俊明，何永林，杨健，李娜【关键词】巨噬细胞Construction of a fusion gene expression vector containing human granulysin and green fluorescent protein gene and its expression in murine macrophage RAW264.7【Abstract】 AIM: To clone the human granulysin from activated cytotoxic Tlymphocytes (CTL), construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of granulysin (GLS) and green fluorescent protein reporter and observe its expression in murine macrophage RAW264.7 strain. METHODS: The coding sequence of the granulysin was amplified from the total RNA of human CTL activated by allogenic antigen after reverse transcription by NestedPCR, inserted into pEGFPC1 plasmid and then transfected RAW264.7 cells. The expression of the fusion protein and GLS was detected by fluorescence microscope and RTPCR. The immunoreactive of the product was confirmed by immunocytochemistry method. RESULTS: The whole coding sequenceof GLS was successfully amplified as expected. The accurate open reading frame (ORF) of the fusion protein recon was confirmed by PCR, endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein that was immunoreactive was successfully expressed in the targeted cells. CONCLUSION: Human granulysin can be expressed in murine macrophage RAW264.7 strain in a fusion protein pattern and retain its immunoreactivity.【Keywords】 granulysin； green fluorescent protein；macrophage； nestedPCR；immunoreactivity【摘要】目的: 克隆人天然颗粒溶素(granulysin，GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体，观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达. 方法: 提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA，经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列，插入pEGFPC1质粒，鉴定正确后转染RAW264.7细胞，采用荧光显微镜及RTPCR法检测融合蛋白及GLS的表达，采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性. 结果: 成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA，经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达，表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达，其表达产物具有良好的免疫反应性.【关键词】颗粒溶素；绿色荧光蛋白；巨噬细胞；套式PCR；免疫反应性0引言颗粒溶素（granulysin，GLS）对细菌、真菌、原虫、肿瘤细胞等具有很强的广谱杀伤活性，因此对其免疫杀伤作用机制的研究对于开发天然、低毒、高效的新一代杀菌制剂以及研究人体的天然免疫过程具有重要意义. 为此我们直接从激活后的人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAW264.7中进行了表达.1材料和方法1.1材料E.coli Top10, Clontech公司质粒载体pEGFPC1为本室保存;小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药理学教研室. 人外周血单个核细胞(PBMC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPE I，BamH I购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）,高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司； GenePorter 2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.1.2方法根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1: 5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′; PG2: 5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′; PGE1: 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCTTCTC3′; PGE2: 5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′; 全部由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列. 首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录. 方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6 mL，肝素抗凝. 1500 r/min离心10 min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞. 取其中一份PBMC样本洗涤2次后以含100 mL/L自体血浆的完全RPMI 1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200 mg/L，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中，培养24 h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100 mL/L灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液重悬）共同培养48 h后收获细胞.1.2.1GLS cDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq, 用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLScDNA全长片段. 然后取产物2 μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环； 72℃延伸8 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测. 纯化后以BsPE I，BamH I双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1 h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30 mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3 mL含30 mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPE I与BamH I进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序.1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAW264.7细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，以24孔板置37℃，50 mL/L CO2培养，常规方法制作RAW264.7细胞爬片，至80%~90%汇片后按转染试剂盒说明进行转染，以pEGFPC1空质粒转染的RAW264.7细胞作为对照.转染72 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞:①取出爬片进行荧光检测，观察融合蛋白的表达及分布；②以RTPCR法对GLS基因进行转录水平上的检测：抽提细胞总RNA逆转录，以PGE1, PGE2为引物，按上述条件进行扩增；③GLS表达产物的免疫学活性检测：取出爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法是：PBS洗，40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗，30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min； PBS洗，滴加血清封闭液，室温20 min；滴加1∶300稀释的山羊抗人GLS抗体，4℃过夜；PBS洗，滴加生物素化的兔抗山羊抗体，室温20 min；PBS洗，滴加链酶亲和素生物素酶复合物（SABC）液，室温20 min；PBS洗，DAB避光显色20 min；苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，观察. 2结果2.1GLS cDNA的套式PCR扩增两次PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在433，754 bp处见到一特异性目的片段，与理论预测的GLS全长cDNA序列大小相符(Fig 1).2.2重组质粒的PCR及酶切鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后，电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带. 分别抽提质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明,酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(Fig 2).2.3GLS转录产物的RTPCR检测转染72 h后抽提细胞总RNA 以原引物作RTPCR重新扩增出目的片段为433 bp，与理论预测值完全相符(Fig 3).2.4GLS与EGFP融合蛋白的荧光检测转染72 h后融合蛋白表达产物主要定位于细胞质(Fig 4).2.5GLS表达产物的免疫细胞化学以山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，DAB显色可见GLS呈强阳性表达(Fig 5).3讨论一般认为清除结核杆菌等胞内寄生菌的感染主要依赖人体的细胞免疫反应，可以运用结核杆菌的单一［1］或融合形式［2］的保护性抗原构建基因疫苗激发人体的Th1型细胞免疫反应来防治结核病. 在这一过程中，细胞毒性淋巴细胞起着关键作用. 激活的CTL细胞和NK细胞产生的GLS是一种细胞毒性免疫效应分子. Ogawa等［3］认为血清GLS的水平是评价机体细胞免疫功能状态的新指标. Kida等［4］利用拉氏无胆支原体（Acholeplasma laidlawii）刺激人单核细胞来源的THP1细胞株，在其中检测到了GLS mRNA的表达，并认为特定刺激在巨噬细胞中诱导产生GLS可能是机体一种有效的抗微生物入侵的保护机制. 利用真核表达载体（如pcDNA3.1）已经在多种真核细胞株如YT，HuT78，COS7（非洲绿猴肾细胞）中表达出了具有生物学活性的GLS［5］. 绿色荧光蛋白是目前公认较为优良的一种标记基因，与目的基因融合后不会影响表达产物的生物学活性，新近Hanson等［6］采用绿色荧光蛋白作为报告基因与GLS作C端融合，也在YT细胞中得到了成功表达，但GLS在鼠巨噬细胞中的表达迄今为止未见报道. 我们利用套式RTPCR的方法从激活的人外周血PBMC中直接扩增出了GLS 的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白的融合表达载体，在体外从细胞水平检测到了其转录与表达，这说明人GLS是能够定位在小鼠巨噬细胞胞质中进行表达的，从而为后续在活体动物模型中的应用及研究其免疫杀伤机制奠定了基础.【参考文献】［1］骆旭东, 朱道银, 陈全, 等. 结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗免疫原性的比较［J］.第四军医大学学报,2003; 24（17）:1630-1631.Luo XD, Zhu DY,Chen Q, et parison of immunogenicity of DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis Ag85B and MPT64［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（17）:1630-1631.［2］江山, 朱道银,蒋英,等.结核分枝杆菌Ag85BAg85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达［J］. 第四军医大学学报,2003;24（21）:1973-1975.Jiang S, Zhu DY, Jiang Y, et al.Construction of fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24（21）:1973-1975.［3］ Ogawa K, Takamori Y, Suzuki K, et al. Granulysin in human serum as a marker of cellmediated immunity［J］. Eur J Immunol, 2003; 33(7):1925-1933.［4］ Kida Y, Shimizu T, Kuwano K. Opposing roles of activator protein1 and CCAAT/enhancer binding protein beta in the regulation of inducible granulysin gene expression in a human monocytic cell line,THP1［J］. Immunology, 2002；107(4):507-516.［5］Hanson DA, Kaspar AA, Poulain FR, et al. Biosynthesis of granulysin, a novel cytolytic molecule［J］. MolImmunol， 1999； 36(7):413-422.［6］ Hanson DA, Ziegler SF. Fusion of green fluorescent protein to the Cterminus of granulysin alters its intracellular localization in comparison to the native molecule［J］. J Negat Results Biomed, 2004;3(1):2.（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。

人线粒体融合蛋白—2基因真核表达载体的构建与鉴定目的构建人线粒体融合蛋白-2 （mitofusin-2，MFN2）基因真核表达载体并对其进行鉴定。

方法在pEGFP-N1载体多克隆位点插入人MFN2基因编码区序列，酶切、测序验证是否插入及正确性。

将所构建载体转染原代培养的人血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs），荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达；荧光定量PCR和Western blot分别检测MFN2 的mRNA及蛋白表达。

结果成功构建了人MFN2 基因真核表达载体，其转染VSMCs后，可以检测到MFN2 mRNA及蛋白水平高表达（P＜0.01）。

结论成功构建了人MFN2基因真核表达载体，且能够在原代VSMC中过表达。

标签：线粒体融合蛋白-2；载体构建；鉴定血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）形成的中心环节。

线粒体融合蛋白-2 （mitofusin-2，MFN2）是一种细胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖[1，2]。

本研究拟通过构建人MFN2基因真核表达载体，并将其转染原代人脐静脉平滑肌细胞，荧光定量PCR法及Western blot检测MFN2 mRNA及蛋白表达，为今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基础。

1资料与方法1.1一般资料原代人脐静脉平滑肌细胞由本实验室培养；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自Hyclone公司；大肠杆菌感受态DH5α购自北京博迈德生物科技公司；真核基因表达载体pEGFP-N1购自Clontech公司；Taq DNA 聚合酶购自宝生物公司；限制性内切酶Bgl II及EcoR I、T4 DNA连接酶均购自Fermentas 公司；逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Fermentas公司；TRIzol试剂、转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗体购自北京博奥森生物科技有限公司。

三叶因子2基因真核表达载体的构建作者：张绍荣，杨晓强，邢锐，宋于刚，陈学清【关键词】胃溃疡Construction of eukaryotic expression vector of human TFF2 gene【Abstract】AIM: To construct a eukaryotic expression vector of human TFF2 gene. METHODS: We assembled a TFF2 gene in pfu mix reaction system and cloned it to pGMT easy vector. The positive colonies were first confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing and then were inserted to eukaryotic expression vector pcDNA3.1 and verified by enzyme digestion and sequencing. RESULTS: After TA colon of synthetic TFF2, the positive colonies were finally verified by sequencing, which were totally in line with the designed coding sequence of TFF2 gene. CONCLUSION: Eukaryotic expression vector of human TFF2 gene has been successfully constructed, which provides a basis for further investigation of gastric ulcer.【Keywords】eukaryotic expression vector；TFF2 gene; gastric ulcer【摘要】目的：构建TFF2pcDNA3.1真核表达载体. 方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2，然后TA克隆于pGMT easy载体中. 阳性克隆经测序鉴定. 再经双酶切消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1上，经酶切鉴定与测序证实. 结果：合成的TFF2经TA克隆后，筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定，与设计的TFF2基因序列完全一致. 经酶切连接并成功插入pcDNA3.1上. 结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础.【关键词】真核表达载体；TFF2基因;胃溃疡0引言某些生长因子的缺乏或者减少是消化性溃疡难以治愈的原因之一. 三叶因子2（Trefoil factor 2, TFF2）在生理条件时能保持胃黏膜完整与稳定，在急性损伤时分泌增多，在消化性溃疡中有特异表达，提示其在维持胃肠道黏膜的完整性和促进快速修复过程中起重要作用,在消化性溃疡的治疗中有一定的应用前景. 我们用体外基因拼装技术合成TFF2，并构建该基因的真核表达载体.1材料和方法1.1材料Taq酶.PCR凝胶回收试验盒和限制性内切酶为TaKaRa公司产品. 所有寡核苷酸和PCR引物片段均由上海博亚生物有限公司合成. pGEMT easy试剂盒购自Promega公司. 1 kb DNA ladder，Maker III，pfu PCR Master mix购自北京天为时代生物公司. pcDNA3.1 为我研究所保存. 其他试剂均为化学分析纯. 1.2方法根据已知人的TFF2基因的蛋白序列（GeneBank登录号：NP_005414）来设计合成TFF2表达cDNA序列. 我们还在TFF2的信号肽和成熟TFF2之前，插入一段cmyc的标记(tag)，形成cmycTFF2. 为便于进一步的亚克隆，在cmycTFF2的氨基端添加BamH I酶切位点，在羧基端（即终止密码子之后）添加EcoR I和Xba I酶切位点. cmycTFF2最终设计序列约450 bp. 然后，按每40 bp的核苷酸的长度设计22条引物，参考有关文献［1］进行. 产物经电泳后，切取所需条带用PCR凝胶回收试验盒进一步纯化. 再用上下游两末端引物扩增35个循环后，加入25 mmol/L浓度的dA TP 1 μL，72℃保温15 min. 取上述PCR终产物约3 μL，用pGMT easy试剂盒进行TA克隆. 方法按Promega公司提供的说明书进行. 克隆产物经EcoR I酶切鉴定后送博亚生物公司进行测序. 应用质粒小量提取试剂盒，提取测序正确的阳性克隆重组质粒经EcoR I和BamH I双酶切及琼脂糖凝胶电泳后，以柱式小量切胶回收试剂盒回收400 bp左右大小的电泳条带，质粒pcDNA3.1用相同的酶酶切后用乙醇沉淀法回收大片段，将回收的大小片段按1∶8的分子比用T4连接酶连接，用低温氯化钙法转化宿主E. coli DH 5α感受态细胞涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB培养基上用EcoR I和BamH I酶切鉴定［2］，阳性克隆送博亚生物公司测序.2结果将按TFF2基因设计的40 bp的寡核苷酸混合，用pfu Master mix进行拼装，结果发现，在第1次扩增时，电泳带呈拖尾状（smearing），并没有发现有明确的条带出现，但拼装的产物经稀释，再加入两端的引物进行第3次扩增时，可以见到所需的420 bp的条带（图1）. 在它的前后面有较弱的梯形带. 为进一步得到更纯的产物进行克隆，我们将产物纯化，再用未端引物进行PCR扩增，可见到一条非常清晰的目的基因带. 为进一步克隆，我们将PCR产物在Taq酶存在的条件下，进行未端加T. 然后，连接于pGMT easy载体. 将连接产物转化至大肠杆菌中，经蓝白斑筛3讨论三叶肽是一类较新的胃黏膜保护因子，成熟的TFF2是一个由106个氨基酸组成的蛋白质，我们利用PCR技术，在体外成功地拼装了TFF2基因. 这一技术是在以往同类研究的基础上进行改良的. 但与原方法相比，操作更为简单、方便和快捷. 我们采用的PCR拼装系统为pfu Master mix. 这省去了优化PCR系统的时间，并且由于pfu酶复制的真实性，可以真实地保持产物与设计的一致性. 在实验中，我们还采用了TA克隆的技术对产物进行克隆，而不是如原方法那样，首先在产物中设计好酶切位点，大量扩增产物后将产物纯化，然后进行酶切，再纯化后克隆，而是对产物直接进行克隆. 这大大减化了操作步骤并提高了效率. 另外，以前的方法中采用了pfu和Taq酶的复合物作为拼装体系，由于Taq酶缺乏纠错能力，有使产物出现突变的可能. 而我们在进行产物拼装和扩增时完全用pfu酶，因而，更高地保证了产物拼装的真实性. 我们将拼装的TFF2基因连接于pGMT easy载体，拼装的TFF2序列与设计序列完全一致. 又进行双酶切将TFF2切下来连接至pcDNA3.1上，经转化克隆，得到所需要的带有TFF2的真核表达载体. 经酶切鉴定及测序与设计TFF2序列完全一致.【参考文献】［1］陈学清，王亚东，孙勇，等. 体外拼装凋亡素基因［J］. 第一军医大学学报，2005，25（2）：195-197.［2］王中华，窦科峰，杜建军，等. 人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达［J］. 第四军医大学学报, 2003,24（11）：968-971.。

・学术交流・pcDNA3-hN GFb真核表达载体的构建及其表达邓兴力　杨智勇　董坚　王廷华　徐丹　冯忠堂【摘要】　目的　构建人神经生长因子β(N GF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。

方法　以R T-PCR从人脑组织总RNA中扩增N GF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定N GF-β在细胞内的表达。

结果　R T-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hN GFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人N GF-βcDNA完全一致。

将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明N GF-β及其前体proN GF-β能在真核细胞中正确表达。

结论　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,为后续的研究奠定基础。

【关键词】　神经生长因子;　真核表达;　重组质粒;　转染C onstru ction o f recombinant plasmid pcDN A32hNG Fb and its exp ression　DEN G Xing2li,Yang Zhi2yong,DO N G J ian,et al.　De partment of N eurosurgery,1st A f f iliated Hos pital of Kunming MedicalCollege,Kunming650032,China【Abstract】　Objective　To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb and investigate its expression in L929cells.Methods　The cDNA of human nerve growth factorbeta subunit(N GF-β)was amplified by R T-PCR from human brain tissue.By gene recombinationtechnique,human N GF-βcDNA was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.The recombi2nant plasmid was verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Transfected the recom2binant vector into L929cells with Lipofectamine2000transfection reagent.The expression of N GF-βwas analyzed by immunocytochemistery as well as western blot.R esults　The R T-PCR product is750bp specific segment.By restriction enzyme digestion,the recombinant plasmid was digested into750bp and5.2kb f ragments.DNA sequence result showed the750bp f ragment was identical with humanN GF-βcDNA in GenBank.Immunocytochemistery and western blot showed the N GF-βwas expressedsuccessfully in L929cells.Conclusions　The recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb was constructedsuccessfully,which will provide the foundation for f urther research.【K ey w ords】　Nerve growth factor(N GF);Eukaryotic expression;Recombinant plasmid;T ransfection中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)022******* 神经生长因子(nerve growt h factor,N GF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。

3山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目(2004BS01012);　33通讯作者:E -mail :grli66bethesda @ 收稿日期:2008-06-20pEGFP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达3王　栋 何成强 杨桂文 李国荣33(山东师范大学生命科学学院动物抗性生物学重点实验室,250014,济南∥第一作者24岁,男,硕士生)摘要　目的　利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物(t -PA )基因并构建一种能高效、安全表达t -PA 的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础.方法　采用高效T riz ol 试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA ,RT -PCR 获得t -PA cDNA ,并将真核表达质粒pEG FP -N3和t -PA 基因片段分别双酶切,将回收的pEG FP -N3大片段(4.7kb )与t -PA 基因片段(1.1kb )重组.对pEG FP -N3-t -PA 质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定.脂质体介导pEG FP -N3-t -PA 转染成纤维细胞(NIH 3T 3),并用RT -PCR 法从mRNA 水平检测t -PA 的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NIH 3T 3细胞中的表达.结果　成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t -PA 基因,并构建了以pEG FP -N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t -PA.结论　含t -PA 基因真核表达质粒构建成功.关键词　组织纤溶酶原激活物;　真核表达质粒载体;　基因克隆;　成纤维细胞中图分类号　Q 344.13组织型纤溶酶原激活剂(tissue -type plasminogen activator ,t -PA )是一种丝氨酸蛋白酶,在体内广泛分布于血管内皮细胞、脑、成熟的卵母细胞、输卵管、胰腺等组织[1].它是由527个氨基酸组成的单链丝氨酸蛋白酶,具有选择性地在纤维蛋白表面活化纤溶酶原的性质,除参与机体凝血和纤溶的平衡调控外,还具有高效、特异的溶栓作用,是目前防治血栓性疾病最有效的药物之一[3,4].本研究用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse T ranscriptase RT -PCR )技术,成功地从黑色素瘤细胞中克隆了人t -PA cDNA ,构建了含t -PA 基因的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒载体,以期为探讨基因防治、以及转基因动物的研究奠定基础[1,2].1　材料与方法1.1　主要试剂　pEG FP -N3真核表达质粒由本实验室保存,总RNA 提取试剂盒,质粒提取试剂盒,RT -PCR 试剂盒,大肠杆菌菌株E .coli DH5α由天根生化公司提供,限制性内切酶,T 4DNA 连接酶,Ex T aq 酶、pM D18-T 载体由大连宝生生物公司提供;Lipofectamine 2000购于Invitrogen ;黑色素瘤细胞,成纤维细胞系(NIH 3T 3)由本实验室保存.其余试剂为电泳纯或分析纯.1.2　t -PA 基因引物设计　从G enBank 中查找下载人的t -PA 基因序列,由MEG A 4.0分析软件对t -PA 序列进行分析,阅读其框架,选取其具有功能的1060bp 的片段,根据引物设计原则设计一对引物,其5′端引物引入Hind Ⅲ酶切位点,3′端引物引入BamH I 酶切位点,并分别在上、下游引物的5′端引入4个保护碱基.上游引物是:5′-CG AT CG AAG CTT CG ATG T CTT AT C AGGG AAAC AG TG ACTG CT -3′(Hind Ⅲ);下游引物是:5′-C ATG ACGG AT CCCGG T CG C ATG TTG T C ACG-3′(BamH I ).1.3　t -PA 基因cDNA 克隆　依据T rizol 试剂盒说明,从人黑色素瘤细胞中提取总RNA ,按逆转录试剂盒使用说明进行RT -PCR 反应合成cDNA 第一链,然后以其为模板进行PCR 反应.取逆转录产物1μl ,加入5μl 10×Reaction Bu ffer ,4μl dNTP 混合物(2.5mm ol ΠL ),1μl Pyrobest DNA 聚合酶(2U Πμl ),t -PA 上游引物、下游引物各1μl ,加ddH 2O 至总体积50μl.将反应体系置于PCR 仪中,94℃预变性5min ,94℃30s ,56℃45s ,72℃1min ,31个循环后72℃延伸10min.1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,并按回收试剂盒说明对RT -PCR 产物快速纯化回收.1.4　PCR 扩增产物的克隆和鉴定　PCR 产物回收后,在T 4DNA 连接酶的作用下,与pM D18-T 载体连接,16℃水浴4h ,连接产物转化入E .coli DH5α感受态细胞.37℃培养过夜,挑取转化生长的阳性菌落,应用质粒提取试剂盒提取重组质粒,分别用PCR 和双酶切对重组质粒进行鉴定.并送菌种至华大基因科技公司对阳性克隆片段进行双向测序分析.9012008年12月第23卷　第4期山东师范大学学报(自然科学版)Journal of Shandong N ormal University (Natural Science )Dec.2008V ol.23N o.41.5　pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒的构建[5]　用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切回收的t -PA 片段定向插入用同法酶切的pEG FP -N3载体启动子下游,得到重组质粒pEG FP -N3-t -PA.构建过程见图1.1.6　pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定　用构建的pEG FP -N3-t -PA 重组质粒转化E .coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,扩增,提取并纯化重组质粒DNA ;将重组质粒用双酶切(Hind Ⅲ和BamH I )鉴定.1.7　pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒转染成纤维细胞　将NIH 3T 3细胞培养至对数生长期,接种于6孔板,待细胞密度为70%～80%时,用Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染,转染方法按说明书进行.重组质粒量为2μg Π孔.加入转染试剂和质粒后,细胞放置37℃5%C O 2孵育箱孵育4h ,去除转染复合物并加入含10%小牛血清的新鲜培养液,培养24～48h ,荧光显微镜下观察.1.8　RT -PCR 法检测质粒转染成纤维细胞后t -PA 基因的mRNA 表达　收集培养的成纤维细胞(1.5×106个Πm l ),按T rizol 试剂盒说明书提取总RNA ,并以它为模板进行RT -PCR ,扩增t -PA cDNA ,其程序同前.图1　pEG FP -N3-t -PA 构建图图2　人黑色素瘤细胞中t -PA 基因的RT -PCR 产物1.DNA M arker D L2000;2、3、4、5.t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.图3　pM D18-T -t -PA 重组质粒的鉴定结果1.重组质粒pM D18-T -t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物;2.质粒pM D18-T -t -PA ;3.重组pM D18-T -t -PA 经Hind Ⅲ和BamH I 双酶切;4.DNA M ark D L2000plus.2　结 果2.1　t -PA 基因片段的扩增　用所设计的引物,对人黑色素瘤细胞中的t -PA 进行RT -PCR 扩增,其扩增的基因片段大约为1.1kb ,其中含酶切位点、起始密码子和终止密码子,结果见图2.2.2　t -PA 基因片段与pM D18-T 质粒连接和重组质粒的鉴定　纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pM D18-T 质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pM D18-T (2.6kb ).结果见图3.2.3　测序结果及比对分析　将华大公司测序结果与G ene Bank 中的t -PA cDNA 序列进行比对,结果完全一致,见图4.2.4　t -PA 基因片段与pEG FP -N3质粒连接和重组质粒的鉴定　纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pEG FP -N3质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pEG FP -N3(4.7kb ),结果见图5.2.5　pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达　采用脂质体法将pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞24h 后,倒置荧光显微镜下观察,见转染后的NIH 3T 3细胞发出的绿色荧光,说明质粒转染NIH 3T 3细胞后有融合蛋白的表达,见图6.2.6　RT -PCR 法检测t -PA 基因转染成纤维细胞后t -PA mRNA 表达水平　经对pEG FP -N3-t -PA 转染的细胞总RNA 进行扩增,结果转染重组质粒组扩增出约1.1kb 左右的cDNA 片段,见图7.11第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期　图4　DNAstar 将测得序列与G enBank中已知序列E01466比对结果图5　pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定结果1.D N A M ark D L2000plus ;2.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经H indⅢ和BamH I 双酶切后产物;3.质粒pEG FP -N3-t -PA ;4.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物.图6　pEG FP -N3-t -PA 质粒转染 NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达图7　t -PA 转染NIH 3T 3RT -PCR 结果1.DNA M arker D L2000;2.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 转染NIH 3T 3细胞后t -PA 基因RT -PCR 扩增产物;3.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 经PCR 扩增t -PA 基因产物;4.未转染质粒的NIH 3T 3细胞t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.3　讨 论人组织型纤溶酶原激活剂(t -PA )由于对血栓具有较好的特异性亲和作用,溶栓效果好,溶栓后再出血的发生率低,在心肌梗塞症状发作后的短时间内给药效果明显,安全性高已经成为治疗血栓性疾病的首选药[5].但是其半衰期短,需持续用药,费用极为昂贵又使其大规模应用于临床受到了限制,因此将外源性t -PA基因导入体细胞,使之在局部持续分泌出活性较高的基因产物,以防治血栓形成的方法,具有良好的应用前景[6,7].用质粒携带目的基因转染靶细胞可以获得良好的目的基因表达,并且质粒制备简单,成本低,较少产生抗原性,重复使用性好,安全性高,适合临床应用[8].我们选用的真核质粒pEG FP -N3是一种新型真核表达载体,能在大多数哺乳动物细胞内高效表达,该载体除保留有能在多种细胞中促进重组蛋白高表达的人巨细胞病毒(C M V )增强启动子及易于插入外源基因片段的多克隆位点外,还含有EG FP 报告分子,当其和目的基因一起融合表达时,无需加任何底物、荧光性质稳定、对细胞无毒性、使用方便.这为我们后期转基因动物的鉴定及基因表达位置的确定奠定了基础.本研究通过应用基因重组技术,成功构建了pEG FP -N3-t -PA 真核表达载体;将该载体转染NIH 3T 3细胞,荧光显微镜下观察证实该载体在真核细胞内可成功表达t -PA -EG FP 融合蛋白,这为今后血栓相关性疾病的t -PA 基因治疗研究奠定了坚实的基础,也进一步为利用显微注射法制备转基因动物铺平道路.111第4期王　栋,等:pEG FP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞细胞中的表达第23卷　第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期　4　参考文献[1]　H oylaerts M,Rijken D C,Iijnen H R,et al.K inetics of the activation of plasm inogen by human tissue plasm inogen activator[J].J Biol Chem,1981,(257):2912[2]　张永忠.转基因动物的应用与展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2001,16(1):83～87[3]　C ollen D.On the regulation and control of fibrionlysis[J].Thromb Haem ostasis,1980,43(1):77[4]　Bell L D.Chem ical synthesis,cloning and expression in mammalian cells of a gene coding for human tissue-type plam inogen activator[J].G ene,1998,63(4):155[5]　萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南第三版[M].黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.45～105[6]　W augh J M,K attash M,Li J.et al.G ene therapy to prom ote thromboresistance:Local overexpression of tissue plasm inogen activator to prevent arterialthrombosis in an in viv o rabbit m odel[J].Proc Natc Acad Sci US A.1999,96(3):1065～1070[7]　张会亮,王建英,等.tPA特性及其利用转基因乳腺生物反应器生产研究进展[J].山东医药,2008,48(1):143～144[8]　庄文忠.动植物生物技术的交叉渗透及展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2002,17(1):79～80CLONING OF THE t-PA GENE AN D CONSTRUCTION OFpEGFP-N3-t-PA EXPRESSION VECTORWang D ong He Chengqiang Y ang G uiwen Li G uorong(C ollege of Life Science,K ey Laboratory for Animal Anti-S tress,Shangdong N ormal University,250014,Jinan,China)Abstract　Objective T o construct a recombinant eukary otic expressing vector pEG FP-N3-t-PA including functional region of human tissue-type plasminogen activator(t-PA)gene to provide a basis for further study on the research of transgenic animals.Methods The t-PA cDNA was obtained from melanoma cell with RT-PCR and inserted into the Hind III and BamH I site of the plasmid pEG FP-N3,then,pEG FP-N3-t-PA was trans fected into NIH 3T3mediated by Lipfectin2000T M.The recombinant plasmid was proved success ful by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The expression of the chimeric protein was con firmed by fluorescent microscope and the t-PA expression level was tested by RT-PCR.The t-PA gene was cloned and the pEG FP-N3-t-PA vector was constructed.The t-PA expression in the eukary otic cell could be detected in the group with trans fected t-PA gene.The recombinant eukary otic expression plasmid is success fully constructed.K ey w ords　T issue-type plasminogen activator;　Eukary otic expression plasmid;　gene cloning;　NIH3T3 211。

人神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定
王传恩;阮奕文;姚志彬
【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》
【年(卷),期】1999(020)003
【摘要】目的：构建携带人神经生长因子（ｈＮＧＦ）基因的真核细胞表达载体，为应用ＮＧＦ进行老年性痴呆（ＡＤ）等疾病基因治疗打基础。

方法：
应用基因重组技术将ｈＮＧＦｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，用限制性内切酶酶切分析重组质粒ｐＬＮＧＦＳＮ中ｈＮＧＦ基因的插入方向，用ＰＣＲ、斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交对重组质粒ｐＬＮＧ
ＦＳＮ作进一步鉴定。

结果：ｈＮＧＦｃＤＮＡ已正确地克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，而构建成重组逆转录病毒载体ｐＬＮＧＦＳＮ。

结论：真核细胞表达载体ｐＬＮＧＦＳＮ的成功构建，为进一步开展ＮＧＦ基因治疗ＡＤ等中枢神经系统疾病奠定了基础。

【总页数】1页(P167)
【作者】王传恩;阮奕文;姚志彬
【作者单位】
【正文语种】中文
【相关文献】
1.人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析 [J],
陈晓鹏;胡良鹤;王永
2.人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定 [J], 李甫强;王廷华;董
坚;梅妍;周鸿鹰;项涛;羊惠君
3.人CD134L基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及序列分析 [J], 汤永平;张春艳;邵焰
4.人BLyS基因真核细胞表达载体的构建和鉴定 [J], 张志方;张春艳;林学颜;潘敬运
5.人CD154基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及序列分析 [J], 张春艳;宁波;李树浓;张志方;冯炼强
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达付晓达;高美华【摘要】目的构建含有标签蛋白的人环指蛋白11( ring finger protein11,RNF11)的真核表达载体,并观测其在293T细胞中的表达. 方法使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树；应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达,并将其克隆到pEASY-Blunt载体中,酶切测序鉴定正确后,再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中,酶切鉴定正确后转染293T细胞,Western-blotting测其表达. 结果重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确,将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达. 结论携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功,为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础.%Objective The purpose of this study was to establish a eukaryotic expression vector containing human ring finger protein 11 (RNF11) , and analyze its expression in 293T cells. Methods We constructed a phylogenetic tree of human RNF11 using MEGA5.0, identified the expression of the RNF11 gene from four human gastric cancer cell lines, and inserted it into the pEASY-Blunt cloning vector. After enzyme digestion and DNA sequencing, the target gene was subcloned into the eukaryotic expression vector pCMV-HA. Following restriction enzyme digestion, the plasmid was transfected into 293T cells, and its expression identified by Westernblotting. Results The recombinant eukaryotic expression vector carrying RNF11 showed the correct length after the identified by the enzyme digestion, and the expression of thefusion protein was identified by Western-blot after transfecting the vector into 293T cells. Conclusion The construction and the expression of pCMV-HA-RNFl1 were achieved successfully, which has prepared the experimental ground for further studies of RNF11 and its interaction with other proteins.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2012(025)001【总页数】4页(P31-34)【关键词】环指蛋白;泛素连接酶E3:真核表达载体;胃癌【作者】付晓达;高美华【作者单位】266071青岛,山东省青岛大学医学院免疫学教研室;266071青岛,山东省青岛大学医学院免疫学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q591.2细胞在其生长发育的过程中受到了一系列生长因子的调控。