蛋白质一级结构测序60页PPT

出了890C, 890M.型.
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
每次测定的样品用量从最初的250nmol到二十世纪九十年 代只需几十pmol左右。仪器工作的基本原理主要经过以下 几步： (1) 将待测的蛋白质加入到仪器的旋转杯中。 (2) 在一定的条件下进行Edman降解, 经偶联－裂解－获得 ATZ氨基酸。 (3) 旋转杯一边旋转，一边抽真空，除去Edman降解时残 留的溶剂后, 降解的蛋白质和从蛋白质N末端断裂下来的 ATZ—氨基酸形成薄膜, 贴在旋转杯内壁上。 (4) 从蛋白质N—末端断裂下来的ATZ—氨基酸经氯丁烷 抽提出来。
(1)
高负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
将PTH-氨基酸, 通过高效薄层层析(如聚酰胺薄膜层析)分离, 每一种
PTH—氨基酸在一定的展层剂的条件下，其迁移率是一定的，在薄
膜上的坐标的位置就可以确定。然后与标准的PTH—氨基酸在薄膜
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
1.2蛋白质序列测定的重要意义 蛋白质序列测定主要可以提供以下几种参数:
(1) 为DNA 序列分析找出探针， (2) 作为蛋白质和肽类纯度鉴定 (3) 研究蛋白质的结构及功能之间的关系及蛋白质结构的 同源性。 (4) 确定蛋白质生物活性部位，酶与底物结合及催化位点 (5) 确定核酸密码中与蛋白质序列的起始位点及结束位点 (5) 可以科学的解释蛋白质晶体结构, 蛋白质分子进化的分 支点, 分子遗传疾病发病机理，分子免疫的机理。
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统

+
NH CH C NH CH C
H2O
CH2 CH2 O NH CH C O
Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下， 能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成黄色 二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）。
弱碱
（黄色）
② Edman 降解法(I)
PITC
（pH8.3）
CH3NO2 三氟乙酸
Edman 降解法(II)
② Edman 降解法(I)
PITC法可用来连续测定出60个以上的氨 基酸顺序。
多肽链的选择性降解
化学法：溴化氰(CNBr)水解法，它能
选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成 的肽键。
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
多肽链的选择性降解
酶解法:
胰蛋白酶：得到以Arg和Lys为C-末端的肽段，
产生的肽段数一般等于Arg和Lys总数加1
多肽链的选择性降解 酶解法:糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）
专一性水解芳香族氨基酸羧基端形成的肽 键，若羧基端与Pro相连，则不被水解
多肽链的选择性降解 酶解法:酸性磷酸酶
多肽链的选择性降解 酶解法: 弹性蛋白酶
链 的
的氨
分 子
基 酸
比组
成
，
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端。
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的 是N-端氨基酸分析法。

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-
Leu-脑啡肽
C ys Tyr Phe S G ln S A sn C ys P ro A rg G ly N H 2
牛牛催催产产 素素
牛牛加加压压素 素
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OH
CH3 CH CH2OH
CH O
O
O
HN CH C NH CH C NH CH2 C
In 1992, the Sanger Centre in Cambridge, named after Frederick Sanger, was founded by th第e 3W3页el/共lc9o4m页e Trust and the British
Sanger试剂(FDNB)标记N末 端
• 1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素 的 一 级 结 构 ， 1 9 5 8 年第获32页得/共N94页o b e l 化 学 奖 ；
科学怪才 Fredrick
Sanger •
•
两获诺贝尔奖 （仅4人）， 唯一两获诺贝 • 尔化学奖。
Frederick Sanger (1918- ) is a British
Peptides and Proteins
• 氨基酸的多聚物，分子量大小差异极大，可以是2 或3个到成千上万个氨基酸残基连接而成。
• 两个氨基酸残基之间通过共价的酰胺键（肽键）连 接形成一个二肽；三个氨基酸残基连接成三肽；…； 有限数量的数十个氨基酸残基连接成寡肽；多个氨 基酸残基则连接成多肽；蛋白质可以是成千上万个 氨基酸残基连接而成。
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多肽具有特征性的氨基酸 组成，多肽或蛋白质以酸 水解产生游离-氨基酸的 混合物。当完全水解时， 每一种类型的蛋白质产生 一种特征性的氨基酸比例 或混合物。20种氨基酸 几乎从不以相同的比例出 现在一个蛋白质中，有高 有低，甚至有的只出现一 次或根本不出现。

4.根据核苷酸序列的推定法
蛋白质链 核糖体
（七）肽段在多肽链中次序的决定
重叠肽（overlaping peptide）—— 片段重叠法重建完整多肽链一级结构
片段重叠法重建完整多肽链一级结构 所得资料：
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS
第二套肽段
SEO WTOU
EOVE
RLA
利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼
凑出整条多肽链的AA顺序。
8、确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的 位置 不包括辅基成分分析
（二）鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸 残基
Sanger法（二硝基氟苯反应）
N端
DNS法（丹磺酰氯反应）
Edman法（苯异硫氰酸脂反应）
氨肽酶法
肼解法
C端
羧肽酶法 LiBH4还原法
3.LiBH4还原法
多肽+ LiBH4
水解
α-氨基醇+ n氨基酸
含C—端氨基酸,用层析法鉴定
（三）二硫桥的断裂
几条多肽链通过 二硫键交联在一起。 可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在 下，用过量的巯基乙醇(还原法) 处理，使二硫键还 原为巯基，然后用 烷基化试剂碘乙酸 （ICH2COOH）保护 生成的巯基，以防 止它重新被氧化。
（九）蛋白质序列数据库
60年代中期到80年代初，美国国家生物医学研究基金会 (National Biomedical Research Foundation，简称BNRF) 将搜集到的蛋白质序列和结构信息以“蛋白质序列和结构地图 集”(Atlas of Protein Sequence and Structure)的形式发表， 主要用来研究蛋白质的进化关系。 1984年，“蛋白质信息资源”(Protein Information Resource，简称PIR)计划正式启动，蛋白质序列数据库PIR也 因此而诞生。 1988年，美国的NBRF、日本的国际蛋白质信息数据库 (Japanese International Protein Information Database，简 称JIPID)和德国的慕尼黑蛋白质序列信息中心(Munich Information Center for Protein Sequences，简称MIPS)合 作成立了国际蛋白质信息中心(PIR-International)，共同收集 和维护蛋白质序列数据库PIR。

二. 蛋白质的二级结构
O
C—N 0.132 nm
C
C
C
N
0.132nm
N
C
H
❖ 虽是单键却有部分双键性质 ❖ 周边六个原子在同一平面上
肽键平面
★多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个 平面组成
（三）二级结构单元的种类
1. -螺旋(-helix)
二. 蛋白质的二级结构
鲍林(Linus pauling)
• 肽链内形成氢键，氢键的取 向几乎与轴平行，第一个酰 胺基团的-CO基与第四个酰 胺基团的-NH基形成氢键。
• 右手-螺旋。
蛋白质分子中氢键的形成
（三）二级结构单元的种类
二. 蛋白质的二级结构
2、-折叠(-pleated sheet)
一种比较伸展、锯齿状的肽链结构。
维持β-折叠结构稳定性的力 —— 氢键由 一条链上的羰基和另一条链上的氨基之间 形成，即氢键是在链与链之间形成的。
一级结构是由遗传信息决定的。 一级结构是蛋白质空间结构和特异生物学功能的基础。
H
O
H
O
H—N—CH2—C—OH + H—N—CH2—C—OH
H
OH
O
H—N—CH2—C——N—CH2—C—OH
肽键
性质:分子间脱水反应
蛋白质分子中的共价键与次级键
化学键
共价键
肽键 二硫键
一级结构
氢键
二、三、四级结构
疏水键 非共价键键 盐键
∑BOM物料× 单价 + 作业数量×作业价格 = 制造成本
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SAP成本计算说明_BOM的材料成本核算
Bill of Materials :产品A

多肽链的选择性降解
化学法：溴化氰(CNBr)水解法，它能
选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成 的肽键。
CH3 S：
CH2
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
CH3 S+ C N
CH2
CH2 O
RO
NH CH C NH CH C
CH2
CH3 S C N CH2 O
RO
链 的
的氨
分 子
基 酸
比组
成
，
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端。
(五)分析多肽链的N-末端和C-末端
在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的 是N-端氨基酸分析法。
N末端：
1、Sanger法 2、Edman法 3、DNS-Cl法 4、酶降解法
C末端：
1、肼解法 2、酶降解法 3、硼氢化锂法
N末端： ① 二硝基氟苯（DNFB）法
-ATddC
-ATCGTTddG -ATCGTTGddA
-ATCddG
-ddA
意
产物 ： 按长短排列
图
-ATCGTTGddA -ATCGTTddG
-ATCGTddT
-ATCGddT
-ATCddG
-ATddC
-AddT
-ddA
T
C
G
A
A
G
3'
T
T
电泳后的放射
自显影直读图
G
C
5'
T
A
DNA序列分析
b.Maxam-Gilbert化学修饰法
方法-----对角线电泳
把水解后的混合肽段点到滤纸的中央， 在pH6.5的条件下，进行第一次电泳， 肽段将按其大小及电荷的不同分离开来；