《酶活力测定方法》PPT课件
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酶活性测定的方法
酶活性测定的方法
1. 分光光度法：利用酶反应所产生的光学变化，测定吸光度的变化来推断酶活性的大小。
2. 电化学法：利用酶催化反应产生的电化学反应，测定电流的变化来推断酶活性的大小。
3. 比色法：利用酶反应所产生的还原物或氧化物使某一与之相应的指示剂发生颜色变化，来推断酶活性的大小。
4. 管道法：将酶溶液、底物和指示剂分装在不同的细管内，然后加入底物的初始剂量使反应开始，观察指示剂的变化时间来推断酶活性的大小。
5. 放射性测定法：利用放射性同位素标记底物或产物，测定其放射性的变化来推断酶活性的大小。
酶活力测定的原理和方法
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
切勿反復 凍結-解凍。
酵素失活的原因
• • • • • 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑：
酶反应速度曲线
产 物 浓 度 斜率＝浓度/时间＝V 时间
酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。
酶活力的测定
• 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 • 必须测定酶反应的初速度。 • 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10 倍。 • 酶浓度必须适合。
1、化学法
• 化学法是利用化学反应使产物变成一个 可用某种物理方法测定的化合物。如根 据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来 计算酶的活性。
2、放射性化学法
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
酶活性的测定 PPT
１、酶液的制备
取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放 入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀 浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g 水中离心10min，上清液转入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取２次，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下 保存备用。
２、过氧化物酶活性的测定
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
四、实验结果
以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位
酶活力=—△—A ×D
0.01t
酶的比活力=—△A—×D
0.01Wt
式中， △A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃 薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数， 即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数
CAT过氧化氢酶活性测定方法
酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳）
和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。
大家学习辛苦了，还是要坚持
过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含
过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡
取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放 入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀 浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g 水中离心10min，上清液转入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取２次，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下 保存备用。
２、过氧化物酶活性的测定
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
四、实验结果
以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位
酶活力=—△—A ×D
0.01t
酶的比活力=—△A—×D
0.01Wt
式中， △A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃 薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数， 即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数
CAT过氧化氢酶活性测定方法
酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳）
和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。
大家学习辛苦了，还是要坚持
过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含
过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡
碱性磷酸酶的活力测定 ppt课件
（2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
PPT课件
12
•问题2：
• 如何测定酶活性？
PPT课件
8
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS PPT课件
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
9
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
PPT课件
1
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什 么意义？
PPT课件
2
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
PPT课件
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•问题2：
• 如何测定酶活性？
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8
诊断常用血清酶
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDH
山梨醇脱氢酶
SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶 AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS PPT课件
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
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碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
PPT课件
1
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什 么意义？
PPT课件
2
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。
酶活力及酶课件
3×1000=3000。
酶活力及酶课件
6
2、影响酶作用的因素
1)、酶浓度对酶反应速度的影响
在有足够底物和其他条件不变的情况下，反应 速度与酶浓度成正比 。
当[S]>>[E]时，V=K3×[E]
反 应
速
度
0
酶浓度
酶活力及酶课件
8
2)、底物
Vmax [S] V= Km + [S]
酶活力及酶课件
9
3)、温度对酶反应速度的影响
例: 碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时
[s]为2.5x10-5 M，最适pH为 8.3 [s]为2.5x10-2 M，最适pH为10.0
酶活力及酶课件
14
pH影响反应速度的原因
( 1 ) pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的 解离状态。
( 2 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。
酶活力及酶课件
15
酶活力及酶课件
19
有机磷化合物：抑制蛋白酶或酯酶活性
敌敌畏
敌百虫
萨林
酶活力及酶课件
20
有机砷化合物：与酶的巯基结合而抑制活性
路易斯毒气
酶活力及酶课件
21
（二）可逆抑制作用(reversible inhibition)
抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活 性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被 除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。
[Ef][S] Km =
[ES]
Km [Ef]=[ES] [S]
[Ef][I] Ki =
[EI]
[I] [EI]酶=活[力E及f酶] 课件Ki
40
竞争性抑制作用动力学
酶活力及酶课件
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活力测定的原理和方法
酶的分析检测技术?酶促反应分析?酶活力测定方法酶活力测定方?常见酶类的活力测定方法維持酵素活性緩衝液?緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度兩者都會影響酵素的活性?經常在緩衝液中加入一些物質?經常在緩衝液中加入一些物質以增加酵素安定或保持活性?溫度的影響?濃度的影響以增加試劑的保存?避免潮解分裝凍藏?分裝凍藏
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
-酶活力的测定
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时,
用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖
氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
5.其他方法
除上述方法外，还有一些测定酶活力的方
法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法
等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差,
酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。
世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。
例如，1IU＝lμmol/min；1Kat = 1mol/s
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
1.分光光度法
分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光
部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反
应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间
和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连 续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测
定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都
2.荧光法
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。
该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。
二、酶活力的测定
在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时,
用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖
氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
5.其他方法
除上述方法外，还有一些测定酶活力的方
法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法
等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差,
酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。
世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。
例如，1IU＝lμmol/min；1Kat = 1mol/s
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
1.分光光度法
分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光
部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反
应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间
和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连 续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测
定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都
2.荧光法
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。
该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。
《酶活力测定方法》PPT课件_OK
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19
20
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完 全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定 的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均 明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明 该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的 ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
加热：使酶失效
不同的时间取样
终止反应
测定
8
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
9
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
供试液的a每分钟改变15相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为000316重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法目前常用的方法有cnbr裂解sdspage微量肽图法和胰蛋白酶切rphplc肽图171
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
15
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
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3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完 全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定 的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均 明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明 该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的 ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
加热：使酶失效
不同的时间取样
终止反应
测定
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连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
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示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
供试液的a每分钟改变15相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为000316重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法目前常用的方法有cnbr裂解sdspage微量肽图法和胰蛋白酶切rphplc肽图171
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
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重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
高一生物酶活力测定的一般原理和方法PPT精品课件
(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
课题：探究酶保护剂的最适浓度和提取液的最适pH
单位时
提取液的pH
间内底
物的消 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.0.05 浓 度 0.06
【解析】 （1）审题结合图形和文字，在题目中已经提供了信息“食 品种类多，酸碱度范围广”，所以选择的食品添加剂应该有 较广的酸碱适应范围。从图形中，可以看出木瓜蛋白酶的适 应范围最广，所以可以选作食品添加剂。酶的活力，一般用 酶催化的底物消耗量或者产物生成量来表示。 （2）实验设计，应该明确实验目的：探究酶保护剂的最适 浓度和提取液的最适pH值，所以可以将酶保护剂的浓度和提 取液的pH值作为自变量，因变量为单位时间内底物的消耗量 。
10
20
30
40
50
组别
甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲 乙 丙 甲乙丙
清除血渍时间(min) 67 66 88 52 51 83 36 34 77 11 12 68 9 11 67
清除油渍时间(min) 93 78 95 87 63 91 82 46 85 75 27 77 69 8 68
（4）加酶洗衣粉中的酶是特殊的化学物质包裹的，遇水后 包裹层很快溶解，释放出来的酶迅速发挥催化作用。请说明 这是否运用了酶的固定化技术及其理由。
29 ．（16分）食品种类多，酸碱度范围广。生物兴趣小组拟 探究在食品生产应用范围较广的蛋白酶，查阅相关文献，得知：
(2)该蛋白酶的提取工艺流程如下：
“汉水丑生的生物同行”超级群大型公 益 活动：历年高考题PPT版制作。本课
件为公益作品，版权所有，不得以任 何形式用于商业目的。2012年1月15日 ，汉水丑生标记。
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1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ
Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰
蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,
每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅ
ｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直
至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶
切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶
切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即
确定最佳酶切条件为精3品7医学℃保温20ｈ。
17
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12
次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0.
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供 试 品 溶 液 + 底 物 溶 液
计 时 摇 匀
25.0。 C— +0.5。 C
测 定 ： 每 隔30s， 读 取 A， 共5min
每30s A的改变：0.015～0.018，呈 线性关系的时间不得少于3min。
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A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白 酶单位。
供试液的A每分钟改变
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6
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
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7
3）测定方法：
取样测定法：
酶反应
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为
0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品
37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进
样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,
所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ
ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
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酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。
通常酶活力测定时，先制备酶反应进 程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度 的测定，求得酶的浓度或含量。
统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ1119
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3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
A1 - A2
T
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相当于的单位数为
A1 - A2
0.003:1=
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A2
P=
精0品.0医学03TW
15
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
浓度：A：0.575～.0585 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸
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NH
NH-CO-
H2N-C-NH2CH2CH2-CH-CO2OH5C
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
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酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
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2）酶促反应的条件及影响因素
底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、
适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。
温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或
37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。
辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要
相应的辅酶。
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酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量， 横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。 从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。 通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。
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酶活力测定的要求：测得的反应速度 必须和酶浓度有线性的比例关系，这 也是检验酶反应和测定系统是否适宜、 正确的标准。
加热：使酶失效
不同的时间取样
终止反应
测定
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连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
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示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
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练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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