包含体分离纯化

包涵体蛋白的分离纯化赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。

包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关.细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型.包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。

包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%~95％,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。

1. 包涵体的形成重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时，都可形成包涵体.通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体，一般含有50%以上重组蛋白，其余为核糖体组分、RN A聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分］。

由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。

包涵体形成的原因主要有以下几点：⑴蛋白合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠.蛋白折叠的动力学模型表明：蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。

中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应，因此，折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等) ，致使中间体大量积累，容易形成包涵体；⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成，如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等；⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成；⑸包涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白.包涵体蛋白虽然不具有天然结构、没有活性，但在基因工程中生产重组蛋白，包涵体的形成有一定优势,主要表现在: ⑴重组蛋白高水平表达,有时候可达细胞总蛋白的30％；⑵包涵体密度高（约1. 3mg/m l)[ 12 ］，重组蛋白相对较纯，很容易与细胞成分分离，可减少后续纯化步骤；⑶包涵体结构致密,因而在一定程度上避免了大肠杆菌蛋白酶的降解; ⑷易于毒性蛋白和膜蛋白表达;⑸包涵体的形成降低了重组蛋白在胞质中的浓度,有利于目的基因的进一步表达。

包涵体的纯化和复性总结（二）关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

微生物纯培养—分离纯化方法汇总含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（mixed culture）。

如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（pureculture）。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。

得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。

单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。

３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。

用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

富集培养法的方法和原理非常简单。

我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。

如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。

通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

５、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。

然后快速冷却，并进行接种。

接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。

另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。

1、基因工程包含体纯化的路线：答：要获得天然活性态的目标产物，必须要分离包含体，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。

一般纯化流程如下：收集菌体细胞→细胞破碎→包含体洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白复性获得常见包含体的工艺路线：①机械破碎（高压匀浆、高速珠研磨）→离心获取包含体→加变性剂溶解→除变性剂复性特点：是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂志，使后面的分离纯化简单了。

从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。

缺点：要经过几次离心才能出去大部分的细胞碎片，加工时间较长②机械破碎→膜分离获得包含体→加变性剂溶解包含体→除变性剂复性③化学破碎（加变性剂）→离心除细胞碎片→除变性剂复性2、化学渗透法的特点？答：优点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在细胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。

缺点：①通用性差②时间长、效率低，一般胞内物质释放率不超过50% ③有些化学试剂有毒④化学试剂的加入会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物浓度3、简述盐析的原理？答：盐析是在在高浓度中性盐存在下，蛋白质等生物大分子在水中的溶解度降低，进而产生沉淀的现象。

其原理是：向蛋白质的水溶液中加入电解质后，起初蛋白质的活度系数降低，蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质与水分子的相互作用却加强，因而蛋白质的溶解度增大出现盐溶现象。

继续加入电解质使得离子强度增大，蛋白质表明的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱；同时由于盐离子的水化作用使蛋白质表明疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露疏水区域，从而增大了蛋白质表明疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。

<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

包涵体产物的纯化工艺
纯化涉及从原料中分离和去除杂质以获得纯净化合物的工艺。

对于包含有机或无机物的体产物，其纯化工艺可以根据具体情况进行调整，但以下是一般常用的几种纯化工艺:
1. 结晶：通过温度控制和溶剂选择，使目标化合物从溶液中结晶出来，然后进行过滤、洗涤和干燥等步骤，以获得纯净的产物。

2. 蒸馏：利用成分之间的沸点差异来分离和纯化混合物。

通过加热混合物，使成分按照沸点的高低逐渐蒸发和冷凝，从而分离目标化合物。

3. 萃取：利用不同物质在不同溶剂中的溶解度差异，将目标化合物从混合物中分离提取出来。

常见的萃取方法包括溶剂萃取、液液萃取和固相萃取等。

4. 色谱：利用样品成分在移动相和固定相之间的差异，通过一系列分离和纯化步骤来分离和纯化产物。

常见的色谱方法包括薄层色谱、柱层析、高效液相色谱和气相色谱等。

5. 活性炭吸附：通过将目标化合物吸附在活性炭上，去除混合物中的杂质物质，从而纯化产物。

这种方法常用于水处理、空气净化和溶剂回收等领域。

6. 晶体化学：通过对化合物晶体结构的解析和再合成，消除晶体中的杂质，实
现产物纯化。

以上是一些常见的纯化工艺，具体选择哪种工艺取决于产物性质、目标纯度要求、经济性和实际应用等因素。

生物分离工程部分知识点生物分离效率三个指标：分离纯化浓缩程度，纯化倍数，回收率。

生物分离工程：从发酵液、酶反应液或动/植物细胞培养液中将目标产物提取、浓缩、分离、纯化和成品化的过程。

机械破碎法：固体剪切法(珠磨法、压榨法、撞击法) 液体剪切法（高压匀浆法、超声波破碎）工业常用方法：高压匀浆法、高速珠磨法。

优缺点：高压匀浆优点是细胞经历了高速造成的剪切、碰撞、高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。

缺点是较容易造成堵塞的丝状真菌、放线菌以及较小的G+菌不适合用本法。

高压匀浆一般需多级循环操作，每次循环前需要进行级间冷却。

主要能耗是高压和维持低温操作能量消耗。

高速珠磨破碎法：破碎率与能耗成正比。

增加装珠量或延长破碎时间或增加转速均可提高破碎率，但同时能量消耗和产热增加，提高了制冷费和总能源消耗量。

当破碎率≥80%，能耗急剧增加。

超声波破碎：有效能量利用率低，冷却要求苛刻。

①常用的蛋白质沉淀方法有：盐析沉淀（硫酸铵，低温）、等电点沉淀、有机溶剂沉淀（丙酮/乙醇等有机溶剂）及热沉淀法等。

②有机溶剂沉淀蛋白质的机理是：向蛋白质溶液中加入有机溶剂，水的活度降低。

随着有机溶剂溶度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团的水化程度降低，液体的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。

盐析的主要因素有无机盐的种类，浓度，温度和pH值。

lgS=-β—KsI。

盐的种类影响KS值，离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果好。

温度和pH值影响β，在高离子强度溶液中，温度上升，有利于某些蛋白质失水，因此温度升高，蛋白质溶解度下降。

pH值接近蛋白质等电点有利于提高盐析效果。

水相pH值对弱电解质分配系数具有显著影响。

物理萃取时，弱酸性电解质的分配系数随pH值降低而增大，弱碱性电解质随pH值降低而减少。

弱电解质在水相中发生不完全解离，仅仅是游离酸或游离碱在两相产生分配平衡，而酸根或碱基不能进入有机相，所以萃取达到平衡状态时，一方面弱电解质在水相中达到解离平衡，另一方面，未解离的游离电解质在两相中达到分配平衡。

包涵体蛋白纯化步骤引言：包涵体蛋白纯化是生物技术和生物制药领域中重要的工艺步骤之一。

通过纯化包涵体蛋白，可以获得高纯度的目标蛋白，为后续的研究和应用提供了基础。

本文将介绍包涵体蛋白纯化的一般步骤，包括细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等。

一、细胞破碎：细胞破碎是包涵体蛋白纯化的第一步。

通常使用机械方法（如超声波破碎或高压均质）或化学方法（如洗涤剂破碎）来破碎细胞，释放包涵体蛋白。

需要注意的是，破碎条件应该使得包涵体蛋白能够充分溶解而不会发生蛋白质降解。

二、包涵体回收：包涵体蛋白通常以包涵体的形式存在于细胞裂解液中。

包涵体回收是将包涵体从其他细胞成分中分离出来的过程。

一种常用的方法是通过离心将细胞碎片和其他细胞成分与包涵体分离。

此外，还可以使用过滤、沉淀或超滤等技术来实现包涵体的回收。

三、包涵体溶解：包涵体蛋白在还原条件下通常以不溶性的形式存在。

为了使包涵体蛋白能够溶解，通常需要添加变性剂（如尿素或胍氯酸）和还原剂（如二硫醇）。

通过调节溶解条件，可以使得包涵体蛋白迅速溶解为可溶性蛋白。

四、亲和层析：亲和层析是包涵体蛋白纯化的关键步骤之一。

通过将目标蛋白与亲和层析介质上的亲和配体结合，可以实现目标蛋白的富集和纯化。

亲和配体可以是金属离子、抗体或亲和标签等。

在亲和层析过程中，需要注意选择合适的亲和配体和适宜的洗脱条件，以实现对目标蛋白的高效纯化。

五、蛋白质再折叠：由于包涵体蛋白在还原条件下溶解，其折叠状态通常不完整。

为了使得目标蛋白具有正确的结构和功能，需要对其进行再折叠。

常用的再折叠方法包括逐渐降低变性剂浓度、添加折叠辅助剂和调节pH 值等。

通过适当的再折叠条件，可以使得目标蛋白恢复到天然的折叠状态。

结论：包涵体蛋白纯化是一项复杂的工艺步骤，需要经过细胞破碎、包涵体回收、包涵体溶解、亲和层析和蛋白质再折叠等步骤。

通过这些步骤的有序进行，可以得到高纯度和高活性的包涵体蛋白。

随着生物技术和生物制药的不断发展，对包涵体蛋白纯化技术的要求也越来越高，希望通过不断的研究和创新，能够进一步提高包涵体蛋白纯化的效率和纯度，为生物医药领域的研究和应用提供更好的支持。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

生物分离工程重点绪论1.名词解释生物分离工程的定义：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。

分离容量：指单位体积的分离设备处理料液或目标产物的体积或质量。

分辨率：指目标产品的纯化效果或杂质的去除能力。

2.在大多数生物产品的开发研究中，后处理过程的研究费用占全部费用的50%以上；在产品的成本构成中，后处理成本占总成本的40%-80%；对于精细和药用的产品，此比例就更高, 生产过程中后处理投入的人力和物力占全部的70%-90%。

3.一个完整的分离纯化处理过程可分为三个阶段：目标产物捕获；目标产物初步纯化；目标产物高度纯化和精制。

（1）目标产物捕获作用：除去与目标产物性质有很大差异的杂质，从复杂的料液中分离出目标产物，将产物浓缩并转移到能保护产物活性的环境中。

特点：1）料液的体积变化最大，产物浓缩2）杂质去除量最多3）使用的设备要求较高4）产物的损失和能耗最大步骤：1）原料液的预处理原因：原料液中产物的浓度较低，料液组成复杂，其中所含的各种杂质都会对产物的分离纯化产生很大的影响。

目的：主要用来改进原料液的处理性能。

分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，除去原料液的部分可溶性杂质，为产物的纯化、精制作准备。

方式：调pH、加热、过滤、离心分离（填空选择）2）细胞破碎（2）目标产物初步纯化：利用萃取、沉淀、吸附等方法将目标产物从存在的位置获取初步进行分离纯化，包含体变复性，仍存在较多杂质（3）目标产物高度纯化和精制阶段：最主要的分离方法是层析4.生物分离的一般流程预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品化加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩调pH 离心研磨法膜分离吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法萃取色谱分离无菌过滤超滤膜分离结晶5. 设计前应了解的信息（了解）（1）在设计前，首先要掌握产物的物化性质，包括：溶解度及影响因素：温度、pH值、有机溶剂和盐等；分子量和分子形状：对于高分子物质非常有意义；沸点和蒸汽压：对于热稳定的小分子物质非常有意义；极性大小；分子电荷及影响因素：包括pH值和盐等；功能团：功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据；免疫原性：设计亲和色谱；稳定性及其影响因素：温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)；泳动度及影响因素：pH、离子强度和盐等；等电点（2）成品规格（或产品质量标准）（3）进料的组成和物性（4）生产规模（5）分批分离还是连续纯化（6）危害性6.分离纯化的评价指标：总蛋白；酶活性；比活性；纯化因子；回收率（每步的方法都掌握）（1）回收率（2）纯化因子对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活 A [U/mg]之比表示目标产物的分离纯化程度。

10 蛋白质复性包含体（inclusion body) 重组蛋白质的高表达常常导致其在细胞内发生错误折叠和聚集，形成被成为包含体的聚集体。

包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物，这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，没有生物活性。

以包含体形式表达的蛋白质，需要在回收后溶解，使其肽链伸展（unfolding)，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。

这一过程称为蛋白质的体外再折叠（refolding）或复性（renaturation）。

10.1.1 包含体的形成氨基酸顺序决定了蛋白质的立体结构。

理论上蛋白质折叠成天然活性状态是自发完成的，但伸展的肽链折叠成立体结构的过程受周围环境的影响。

包含体是在表达产物翻译后立即形成，包含体内的表达产物具有部分二级结构。

一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态（intermediates)之间疏水性相互作用的结果，主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。

在大多数情况下，包含体的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋白质种类和表达系统无关。

对于任何蛋白质和任何表达系统，在过量表达的情况下都可能形成包含体。

活性产物N的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓度成正比；聚集体A的形成反应在分子间发生，反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数≥2。

因此如果新生肽折叠成天然活性蛋白质的速度缓慢，新生肽浓度增加和中间态的疏水性相互作用就可能导致包含体的形成。

外源基因基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体，许多蛋白质药物的生产依赖于蛋白质复性技术的提高。

蛋白质的错误折叠和聚集还可能与许多重要疾病（如阿尔茨海默症、疯牛病、帕金森症等）有关。

10.1.2 包含体的性质较大的包含体由于其折光性的不同，可以在显微镜下观察，所以包含体又称光折射体。

以包含体形式表达重组蛋白质具有一定优势：1、包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成，有利于大规模生产目标蛋白质；2、一般包含体蛋白质的表达量都很高；3、包含体富含目的基因表达产物，有利于后续的分离纯化；4、沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解；5、对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含体形式表达是最可取的生产途径。

包涵体纯化技术嘿，咱今儿就来唠唠这包涵体纯化技术！你知道吗，这包涵体就好像是一个神秘的小宝藏，藏在细胞里面呢！要把它纯化出来，那可得有点本事。

想象一下，细胞就像是一个大仓库，包涵体呢，就是仓库里被不小心藏起来的宝贝。

我们要做的就是想办法把这个宝贝找出来，还不能把其他乱七八糟的东西也带出来。

这可不是件容易的事儿啊！首先呢，得把细胞给破开，让包涵体露出来。

这就好比是打开仓库的大门，才能看到里面的宝贝呀。

然后呢，通过一些巧妙的方法，把包涵体和其他杂质分离开来。

这就像是在一堆杂物里，精准地挑出我们想要的那个小物件。

这其中啊，有各种各样的方法和技巧。

比如说，有些方法就像是一个精细的筛子，能把大小合适的包涵体筛出来，把不合适的给挡在外面。

还有些方法呢，就像是有一双神奇的手，能准确地抓住包涵体，而不碰到其他的东西。

纯化的过程就像是一场精细的手术，每一个步骤都得小心翼翼，不能有丝毫的马虎。

要是不小心弄错了一步，那可能就前功尽弃啦！哎呀，这可真让人提心吊胆啊。

而且啊，不同的包涵体可能需要不同的纯化方法呢。

这就好比不同的宝贝需要用不同的工具去挖掘一样。

有的可能很容易就纯化出来了，可有的就像个调皮的小孩，得费好大的劲才能抓住它。

在这个过程中，经验可是非常重要的哦！那些经验丰富的科学家们，就像是熟练的老猎人，能够轻松地找到最佳的方法和路径。

他们知道什么时候该用什么方法，怎么才能让包涵体乖乖地听话。

纯化出来的包涵体，那可都是宝贝呀！它们可以用来做很多重要的事情呢，比如说研究蛋白质的结构和功能，或者用来开发新的药物。

你说这包涵体纯化技术是不是很神奇？它就像是一个魔法，能把那些隐藏在细胞里的宝贝给变出来。

虽然过程充满了挑战和困难，但当我们成功地纯化出包涵体的时候，那种成就感可真是无法用言语来形容啊！所以啊，可别小瞧了这包涵体纯化技术，它可是有着大用处呢！。

以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略点击：112 添加时间： 2007-7-27 9:29:25 分离纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白的步骤为：细胞破碎→包含体洗涤→包含体变性→蛋白复性→层析纯化。

一、包含体的洗涤：纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白，包含体的洗涤至关重要，实验室最常用的破碎细胞的方法是超声破碎，超声处理时，DNA被切断无需再加DNA酶I，超声时产生大量的热，需在冰水浴中间断进行，一般选择超声强度和次数与包含体表达状况有关，表达量高，包含体致密的可以反复多次超声，和多次用超声缓冲液吹洗，8000－10000 rpm/min 10min弃上清，留取沉淀；对于表达量低，包含体不够致密的，在洗涤时就应注意，超声条件要温和，离心速度要提高12000－15000rpm/min 10－15min，必要时可以加入1－5％的TritonX－100和1－4M尿素浸泡过夜，或进行磁力搅拌以增加洗涤强度和净度。

二、包含体的变性常用的变性剂有8M尿素、6M盐酸胍、SDS。

尿素因价格低廉、呈电中性，变性条件温和，稀释复性后可以直接过离子交换剂进行纯化，常作为包含体变性剂的首选。

盐酸胍是强变性剂，复性时易出现沉淀，影响回收，且复性液中必须透析除净盐酸胍后，方可进行离子交换层析分离，不作首选；SDS与蛋白形成带负电的阴离子复合物，并与阴离子交换剂有强吸附，与阳离子交换剂不结合，更致命的弱点是常常会影响蛋白质的生物学活性，不常使用。

变性条件的选择，包含体变性完全与否直接影响进一步的复性，因此包含体的变性一定要完全。

对于易变性的包含体，室温放置或37℃1－3hr，甚至过夜变性，不易变性的包含体，可选择60℃3hr变性。

对于含有二硫键的蛋白质，为了变性完全，使二硫键完全打开，还应加入还原剂ß－ME和DTT。

三、蛋白质的复性蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。

包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。

包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。

在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。

在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。

小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。

回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。

将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。

——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。

细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。

（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。

根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。

向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。

b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

生物分离与纯化技术知识点归纳生物分离与纯化技术知识点归纳在平平淡淡的学习中，不管我们学什么，都需要掌握一些知识点，知识点就是掌握某个问题/知识的学习要点。

哪些知识点能够真正帮助到我们呢？以下是店铺精心整理的生物分离与纯化技术知识点归纳，欢迎阅读，希望大家能够喜欢。

1、生化分离，生化分离技术的基本步骤生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。

来源：（1）动物脏器（2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难。

（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作。

2、吸附技术概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换）常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙‘氢氧化铝等。

活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸附力大于相对分子质量小的化合物。

影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）、溶剂的影响。

3、膜分离技术概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。

特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。

10 蛋白质复性包含体（inclusion body) 重组蛋白质的高表达常常导致其在细胞内发生错误折叠和聚集，形成被成为包含体的聚集体。

包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物，这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，没有生物活性。

以包含体形式表达的蛋白质，需要在回收后溶解，使其肽链伸展（unfolding)，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。

这一过程称为蛋白质的体外再折叠（refolding）或复性（renaturation）。

10.1.1 包含体的形成氨基酸顺序决定了蛋白质的立体结构。

理论上蛋白质折叠成天然活性状态是自发完成的，但伸展的肽链折叠成立体结构的过程受周围环境的影响。

包含体是在表达产物翻译后立即形成，包含体内的表达产物具有部分二级结构。

一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态（intermediates)之间疏水性相互作用的结果，主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。

在大多数情况下，包含体的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋白质种类和表达系统无关。

对于任何蛋白质和任何表达系统，在过量表达的情况下都可能形成包含体。

活性产物N的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓度成正比；聚集体A的形成反应在分子间发生，反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数≥2。

因此如果新生肽折叠成天然活性蛋白质的速度缓慢，新生肽浓度增加和中间态的疏水性相互作用就可能导致包含体的形成。

外源基因基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体，许多蛋白质药物的生产依赖于蛋白质复性技术的提高。

蛋白质的错误折叠和聚集还可能与许多重要疾病（如阿尔茨海默症、疯牛病、帕金森症等）有关。

10.1.2 包含体的性质较大的包含体由于其折光性的不同，可以在显微镜下观察，所以包含体又称光折射体。

以包含体形式表达重组蛋白质具有一定优势：1、包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成，有利于大规模生产目标蛋白质；2、一般包含体蛋白质的表达量都很高；3、包含体富含目的基因表达产物，有利于后续的分离纯化；4、沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解；5、对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含体形式表达是最可取的生产途径。