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人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的人超氧化物歧化酶（SOD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）活性浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：720U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶广泛存在于动物、植物、微生物体内，它能够专一性地清除生物氧化过程中产生的超氧化物自由基，是生物抗氧化系统的重要酶类之一。
1、作为药用酶、保健食品：人的机体内由于各种原因而产生的过量的自由基、特别是超氧阴离子自由基(O2-．)，它对人体内的多种疾病都有关系。
如炎症、放射性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤以及衰老等，所以SOD对治疗自身免疫性疾病如红斑狼疮、风湿类风湿关节炎、肺气肿、心脑血管疾病、延缓衰老等方面都有明显的效果。
通过适当的途径对人体补充适量的SOD对延缓衰老能达到很满足的效果。
现在美国等国为延缓衰老广泛掀起了注射SOD的狂潮，而SOD的售价甚至超过黄金的价格(美国FDA于1998年批准使用SOD)。
作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等海内已有产品出售，商品名称为oigotal oimie oitocetn pdlOCeirt pdvciFlOm等，在我国也有超氧化物歧化酶注射剂的生产。
我们生产的药用SOD的酶比活在3000u ／mg以上，在一4℃冰柜里可保存二年。
2、作为化妆品的添加剂：英国人类基因研究委员会的科学家哈里斯博士指出“科学家过去以为衰老过程是由人体的生物中所预设，但根据基因研究所显示，人体衰老主要是人体的保养及修补系统缺陷”。
英国科学家Hacman則认为人体衰老的主要原凶就是自由基(Fvet)。
在正常情况下，自由基由产生到清除，是处于平衡状态。
由于年龄的增长，自由基逐渐增多，它和人体的蛋白质、核酸、免疫细胞相结合，导致器管老化，免疫力下降。
过氧自由基就通过各种渠道，损害机体，如氧自由基能引起脂质过氧化，过氧脂质与蛋白质交联，产生不溶性蛋白质。
这种变化以结缔组织中胶原蛋白最明显，它能导致胶原变粗，长度缩短，使皮肤失去膨胀力，即所渭皱纹。
此外，过氧化脂质在氧化酶的作用下，能分解成丙二醛等并与邻脂酰乙醇胺之交联生成黄色色素，然后再与蛋白质、核酸等物质形成紫褐色质，即所谓老年斑。
人超氧化物歧化酶的基因序列和mrna序列人超氧化物歧化酶（human superoxide dismutase，SOD）是一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧自由基（superoxide radical）的歧化反应，将其转化为氧气和过氧化氢。
人超氧化物歧化酶的基因序列和mRNA序列是对该酶进行研究时必不可少的重要信息。
人超氧化物歧化酶的基因序列是指该酶所对应的基因在基因组上的排列顺序。
基因是生物体遗传信息的基本单位，它由DNA序列编码。
人超氧化物歧化酶的基因序列在基因组中的位置决定了该基因在细胞中的表达情况。
通过研究基因序列，我们可以了解人超氧化物歧化酶的遗传特征，如基因的长度、是否存在突变等。
人超氧化物歧化酶的mRNA序列是指该酶的基因在转录过程中所产生的mRNA的序列。
mRNA是由DNA模板转录而来的，它携带着基因信息，将其传递到细胞质中参与蛋白质的合成。
通过研究mRNA序列，我们可以了解人超氧化物歧化酶在转录过程中的剪接情况、是否存在可变剪接等。
人超氧化物歧化酶的基因序列和mRNA序列的研究对于了解该酶的结构和功能具有重要意义。
基因序列和mRNA序列的分析可以帮助我们预测和研究人超氧化物歧化酶的编码蛋白的氨基酸序列以及其结构域的组成。
此外，基因序列和mRNA序列的变异分析也可以帮助我们了解人超氧化物歧化酶在不同个体间的遗传差异以及与疾病相关的突变。
人超氧化物歧化酶的基因和mRNA序列的研究还可以为开展药物研发和治疗相关疾病提供重要依据。
人超氧化物歧化酶在细胞内起到抗氧化应激的重要作用，能够清除细胞内产生的有害超氧自由基，从而保护细胞免受氧化损伤。
因此，了解人超氧化物歧化酶的基因和mRNA序列可以为研发针对该酶的抗氧化剂或激活剂提供理论基础。
人超氧化物歧化酶的基因序列和mRNA序列是对该酶进行深入研究的基础信息。
通过分析基因序列和mRNA序列，我们可以了解该酶的遗传特征、蛋白质结构、遗传变异等重要信息。
超氧化物歧化酶(SOD)与自由基的生物学关系及医学临床作用免疫诊断试剂国家工程实验室左有权超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于需氧或耐氧生物机体内的，且极为重要的金属酶。
它通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应进而减轻或消除机体代谢过程中产生的过多的超氧阴离子自由基，在预防疾病、提高人体免疫力等方面均发挥重要的作用，同时在抗衰老、抗肿瘤、抗炎症等方面发挥着重要的作用。
目前已发现并被应用的主要有三种类型Cu，ZnSOD、Mn-SOD；Fe-SOD。
20世纪九十年代人们从链酶菌属发现了Ni-SOD和Fe、Zn-SOD，在牛肝中又发现Co、Zn-SOD，这些均为稀有SOD。
三类主要的SOD中Cu、Zn-SOD为在人体内起主要作用的物质，由2个亚基组成，每个亚基中都含一个Cu2+和一个Zn2+。
Cu2+在活性中心起催化作用，Zn2+起结构作用，主要存在于真核细胞的胞液和线粒体中，呈蓝绿色，相对分子质量为32000；Mn-SOD和Fe-SOD极为相似，Mn-SOD多见于原核细胞中，相对分子质量为40000左右，由2个亚基组成。
而真核细胞线粒体中则有4个亚基组成。
每个亚基中各含一个Mn2+，Fe-SOD多见于原核细胞及少数植物细胞中，为黄褐色。
相对分子质量为38700左右，它由2个亚基组成，每个亚基中各含一个Fe2+。
氧化还原反应是生命体最重要的代谢途径，它不仅为生物提供能量，同时还决定着生命体的衰老和死亡。
氧对于生命活动极其重要，但氧参与的代谢经常产生一些对细胞有毒害作用的副产物——氧自由基，即通常所说的活性氧(reactive oxygen species，ROS)。
细胞产生的活性氧包括:超氧根阴离子(O2-)、氢氧根离子(OH－)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(·O2)和过氧化物自由基(ROO·)。
它们都能通过氧化应激损伤细胞大分子，引起一系列有害的生化反应，造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA突变和酶失活等。
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的总SOD 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：540ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
检验科超氧化物歧化酶（SOD）检测的临床意义一、项目内容超氧化物歧化酶（SOD）是反映人体内自由基代谢状态的重要指标之一，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其水平的高低可间接反映机体清除自由基的能力。
SOD检测项目主要应用于肝脏疾病、心、脑血管疾病、妇产科、儿科、肿瘤、内分泌疾病（如糖尿病等）、肺部疾病、肾病、自身免疫性疾病等患者血清中SOD水平的测定，可实时监测病人体内的自由基水平，以了解机体损伤的情况。
二、超氧化物歧化酶（SOD）检测开展的意义自由基的生理功能：参与、维持细胞的正常代谢；调控基因转录、蛋白质活性；促进前列腺素、脂肪加氧酶生成；参与吞噬细胞杀伤杀灭外来有害微生物、细菌、病原微生物和肿瘤细胞以进行免疫保护；参与肝脏解毒及松弛血管平滑肌降低血压等。
自由基的代谢异常有自由基增高（free radical increase，FRI）和自由基低下（free radical decrease，FRD），以前者为常见。
血清SOD低于129U/ml表示有自由基增高（FRI）。
过多自由基或自由基增高（FRI）的常见原因有：1、受到电离辐射如接受放射治疗，或长时间受阳光紫外线照射。
由于外源辐射供能使体内水分子成不稳定激发态，进而分解生成大量的超氧阴离子自由基（O2－·）；2、长期处在富氧/缺氧环境，如接受高压氧（HBO）治疗。
高压氧吸入时可损伤肺中的巨噬细胞，后者释放化学物质激活中性白细胞可产生自由基O2－·、H2O2等；3、接受手术或救治（如心脏外科体外循环术、脏器移植手术等），或某些原发疾病（如新生儿缺氧缺血性脑病HIE等）出现有缺血再灌注或缺氧后输氧时。
机体缺血时组织中的ATP分解，腺嘌呤分解为黄嘌呤，再灌注时氧分压与pH增高，黄嘌呤脱氢酶转变为氧化酶，O2经单电子还原生成大量自由基（O2－·）。
4、剧烈运动或细胞大量坏死时细胞内自由基的移出，如高强度过量运动、组织损伤（如挤压综合症）、亚健康状态等；自由基增高（FRI）会造成机体影响，引发骨骼肌线粒体氧化应激或炎症性氧化反应，进一步导致自由基链式反应的发生，加剧氧自由基（ROS）异常代谢，促发疾病的发生发展。
人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的人SOD抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）浓度。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120 mU/L，80mU/L ，40mU/L，20mU/L，10mU/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%检测范围：3mU/L - 160mU/L保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月RDHuman Super Oxidase DimutaseGeneric Name：Human Super Oxidase Dimutase (SOD) ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of SOD concentrations in Human serum, blood plasma, and other biological fluids.Principle of the assayT he kit assay Human SOD level in the sample，use Purified Human SOD antibody to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add SOD to wells, Combined antibody which With HRP labeled goat anti- Human become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of SOD in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.Materials provided with the kitSpecimen requirements1.serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.5.Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）, Rapidlyfrozen with liquid nitrogen, maintain samples at 2-8℃after melting,add PBS（PH7.4）, Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m.remove supernatant.6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.7.Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active. Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add Standard 100μl to the first and the second well, then add Standard dilution50μl to the first and the second well, mix; take out 100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately. then add Standard dilution 50μl to the third and the forth well ,mix ; then take out 50μl from the third and the forth well discard, add 50μl to the fifth and the sixth well ,then add Standard dilution 50μl to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standard dilution 50μl to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well, add Standard dilution 50μl to the ninth and the tenth well, mix , take out 50μl fro m the ninth and the tenth well discard(add Sample 50μl to each well after Diluting ,(density: 120 mU/L，80mU/L ，40mU/L，20mU/L，10mU/L)2.add sample：Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is 5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.4.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.7.incubate：Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color change to yellow color).11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes inthe room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolvewhen dilute . Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids theexperimental error. add sample within 5 mins, if the number of sample is much , recommend to use Volley .4.if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the firststandard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly, The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.CalculateAssay range3mU/L - 160mU/LStorage and validity1．Storage ： 2-8℃. 2．validity ： six months.Take the standard density as the horizontal, the OD value for the vertical ,draw the standard curve on graph paper, Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the sample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor, the result is the sample actual density.This chartis for reference only。
