大学生物化学课件 蛋白质结构共21页文档

水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
★DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄 层层析、液相等
★ PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，
有机溶剂抽提，层析。
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§3.4 蛋白质一级结构测序
3、 测序前的准备工作
§3.3 肽
1、 肽和肽键的结构
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§3.3 肽
1、 肽和肽键的结构
★多肽链可以看成由Cα 串联起来的无数个酰胺平 面组成
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§3.3 肽
2、 肽的物理和化学性质
（1）、 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 （2）、 酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－ COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。
Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电
泳行为确定是Glu或是Gln。
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§3.4 蛋白质一级结构测序
5、 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定
（3）、 糖、脂、磷酸基位置的确定
糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖 苷
脂类：Ser、 Thr、Cys 磷酸：Ser、 Thr、His 经验性序列：
§3.4 蛋白质一级结构测序
1、蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至 C端，目前能测100多个N端氨基酸。
（1）、 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法
N A 法裂解 A1 A2 B 法裂解 B1 B2

谷氨酸在生理条件下带负电，而缬氨酸的侧链是一个非极性基团，因此，不仅使血 红蛋白三维结构表面的电荷性质改变了，而且多了一个疏水尾巴，创造了一个“黏 性”突起，促使细胞在脱氧情况下相互粘连形成纤维状多聚体。血红蛋白的这种变 化，促使红细胞变为镰刀状。易在毛细血管处发生堵塞，引起炎症；镰刀形红细胞 易碎裂溶血，导致贫血 高级结构决定性质的典型事例：核糖核酸酶A 核糖核酸酶A经巯基乙醇和尿素处理后，发生变性作用，4对二硫键断裂，多肽链伸 展开来，4对二硫键被还原打断，半胱氨酸侧链出现自由巯基高级结构发生变化， 失去生物活性。如果用透析法将大量变性剂和还原剂除去，在微量还原剂存在下， 4对二硫键重建在原来的位置，伸展多肽链重新折叠成天然高级构象，生物活性得 到恢复
蛋白质的二级结构 ★★★
蛋白质的二级结构是指多肽链中主链原子在各局部空间的排列分布状况，而不涉及各R 侧链的空间排布。在所有已测定的蛋白质中均有二级结构的存在，主要形式包括螺旋 结构、B折叠和B转角等。 构成蛋白质二级结构（即主链构象）的基本单位是肽键平面或称酰胺平面。【肽 键平面示意图一】 肽键具有双键性质，不能自由旋转而成平面结构。此平面结构两侧的、与α 碳原子 相连的单键则可自由旋转。经过折叠、盘曲可形成α -螺旋和β-片层结构。稳定二级结 构的主要因素是氢键。 1. α-螺旋结构 在α-螺旋中肽链如螺旋样盘曲上升，每旋转一圈为3.6个氨基酸残 基，其中每个氨基酸残基升高0.15nm，螺旋上升一圈的高度（即螺距）为0.54nm （3.6nm×0.15nm）。【见示意图二】 每个氨基酸残基的－NH－与间隔三个氨基酸残基的=C=0形成氢键【见详图三】。 每个肽键的=C=0与－NH－都参加氢键形成，因此保持了α -螺旋的最大稳定性。 绝大多数蛋白质以右手α -螺旋形式存在。1978年发现蛋白质结构中也有左手α -螺 旋结构。 2. β-折叠结构 它是两条肽链或一条肽链内的各肽段之间的=C=0与－NH－形成 氢键而成。两肽链可以是平行的，也可以是反平行的。 【顺平行折叠图四】 【反平行折叠图五】 多肽链除此两种局部折叠形式外，还有β转角（β-turn，或称β-发夹结构）和无规 卷曲（random coil）等。

一、 -螺旋
结构要点：
(1)肽键平面为单位,以-碳原子为转折盘旋形成右 手螺旋，螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离 为0.54nm，每个残基沿轴旋转100，上升0.15nm
(2)主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部，直径 约为0.5nm
-螺旋
左、右手螺旋
(3)每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基 酸氨基上的氢形成氢键(共形成n-4个氢 键)，所有肽键都能参与链内氢键的形成， 氢键的方向与中心轴大致平行, 是稳定 螺旋的主要作用力
蛋白质最重要的性质之一
血红蛋白的四级结构
蛋白质的一级结构
一概
念
二 结构特点
蛋白质的分 子结构
一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
——基本结构 空间结构
一、概念：
蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构是指蛋白 质多肽链中氨基酸的排列顺序， 也叫初级结构或基本结构。一级 结构的主要连接键是肽键，通常 将二硫键也归属于一级结构。
3.613 (SN)
(4)Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经 常出现在-螺旋的端头，它改变多肽链的 方向并终止螺旋
二、-折叠
β-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结 构。
侧链基团与Cα间的键几乎垂直于折叠平面，R基团交替地分布于片层 平面两侧。
β-折叠分平行式和反平行式，后者更为稳定。
蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋 白质中的空间排布和亚基间的相互作用。
蛋白质的四级结构
二、四级结构的特点: • 亚基单独存在时无生物活性，只有相互聚合成特定构象时才具有完
整的生物活性 • 亚基之间以非共价键结合，容易彼此解离 • 大多数寡聚蛋白质分子的亚基的排列是对称的，对称性是四级结构

1
双缩脲反应
2
与水合茚三酮反应
3
乙醛酸反应
双缩脲反应
双缩脲反应
•两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红 色的复合物。 •含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生 同样的反应。 •肽键的反应，肽键越多颜色越深。 •受蛋白质特异性影响小。 •蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度。
乙醛酸反应
• 乙醛酸反应 –在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸 沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处， 即有紫色环形成。
本实验采用改良式凯氏定氮装置，将该装置用铁夹和铁环固定于铁架台的适当高度 蒸馏瓶颈部，铁环托住蒸馏瓶底部，并垫上石棉网，套妥冷凝水胶管，准备好用于加 约300瓦的小电炉。
3、实验步骤 （3）蒸馏 ①加吸收液和指示剂 将接受瓶即小锥形瓶中加入4%硼酸溶液10毫升及混合指示剂2滴，置于冷凝管下方
下口尖端插入酸液液面以下。 ②加夹层水（发生蒸汽用） 开通冷凝水，并使自来水由进水口注入蒸馏瓶外侧夹层中，使夹层内水面稍低于蒸
①硫酸铜。 ②硫酸钾。 ③硫酸。 ④混合指示液：1份1g/L甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。 ⑤氢氧化钠溶液(400g/L)。 ⑥硼酸溶液(20g/L)。 ⑦标准滴定溶液：0.0100mol／L HCl标准溶液。 ⑧牛乳
（七）蛋白质
3、实验步骤 （1）准确称取牛乳10ml小心移入已干燥的250mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，6g硫
1、原理 蛋白质为含氮有机物，牛乳中的蛋白质与硫酸和催化剂一同
蛋白质分解，其中C、H形成CO2及H2O逸去，分解的氨与硫酸结 后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以盐酸的标准溶液滴定 耗量得到样液中N的含量，乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

肽链上的氨基酸不是完整的氨基 酸，因而称为氨基酸残基（Amino acid residues）。 一条肽链有两端。 具有游离氨基的一端称为氨基末端 （Amino terminal,或叫N端）。 具有游离羧基的一端称为羧基末端 （Carboxyl terminal，或叫C端）。
3. 肽的书写方法 Calligraph of peptides 书写肽链时，习惯把N端写在左 边，把C端写在右边。 两个氨基酸之间用·或-分开，也 可以用圆圈将氨基酸符号圈开。
4.
二 . 蛋白质的分类 Classification of proteins
1. 根据蛋白质的分子形状分类 Classification according to the shape of protein molecules 球状蛋白质 Globulins 纤维状蛋白质 Fibrins
2. 根据蛋白质的功能分类 Classification according to the functions of proteins 活性蛋白质 Active proteins 酶，转运蛋白，调节蛋白，信号蛋 白，防御蛋白等。 非活性蛋白质 Passive proteins 结构蛋白等。 3. 根据组成分类 Classification according to the composition of proteins 简单蛋白质 Simple proteins 结合蛋白质 Conjugated proteins
2. 由氨基和羧基参与的几种重要化学反应 Several important reactions of amino acids 1）茚三酮反应 Ninhydrin reaction 茚三酮 + 氨基酸 蓝紫色化合物
*
茚三酮反应

链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀， 但并不变性。
* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固
的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。
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蛋白质的沉淀----盐析
*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠 或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面 电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质 沉淀。
NADP+
GSH还原酶
GSSG
NADPH+H+
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蛋白质的分子结构
The Molecular Structure of Protein
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蛋白质的分子结构包括：
一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure)
NH 3
丝氨酸
H2N C CH2 CH COO
Serine (Ser)
O
NH 3
蛋氨酸 Methionine
(Met)
天冬酰胺 Asparagine
(Asn)
HO
CH2 CH COO 酪氨酸 H2N C CH2 CH2 CH COO
NH 3
Tyrosine (Tyr) O
NH 3
谷氨酰胺 Glutamine
间结构，即该段肽链主链骨架原子的相 对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链 的构象 。
稳定因素： 氢键
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（一）肽键平面 形成肽键的C-N键具有部分双键的性质， 使得形成的酰胺键的四个原子及相邻的 Cα处于同一平面上叫酰胺平面或肽键平 面。它是蛋白质构象的基本结构单位。

（1）测定蛋白质一级结构的要求
a、样品必需纯（>97%以上）； b、知道蛋白质的分子量；可以预测AA
数目，工作量大小。 c、知道蛋白质由几个亚基组成；
(2) 测定步骤
A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量 之间的关系，即可确定多肽链的数目。
蛋白质一级结构的测定
CO-NH-CH-CO-NH-CH Nhomakorabea-COOH
CH2 CH2
谷胱甘肽—存在与动、植物及
CH2 SH CHNH2
微生物中：
1.参与体内氧化还原反应 2.作为辅酶参与氧化还原反应
保护巯基酶或含Cys的蛋白质中
COOH
SH的还原性,防止氧化物积累
2GSH
GS-SG
2.蛋白质一级结构的测定
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础。自从1953年测定了胰岛素 的一级结构以来，现在已经有上千种不 同蛋白质的一级结构被测定。
氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基
酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：
Ser-Val-Tyr-Asp-Gln
肽的命名
❖ 从肽链的N-末端开始，残基用酰称呼。 例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,
简写：Ser-Gly--Tyr -- Ala -- Leu，
书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA
催化代谢反应。这是蛋白 质的一个最重要的生物学 功能
调
启
节
动 操纵
乳糖结构基因
基
子 基因
因R
P O LacZ
LacY Laca
1. 催化
mRNA

使Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），溶液中游离的亚铁血 红素很容易被氧化成高铁血红素，但在肌红蛋白中 ，由于血红素处于疏水环境中，血红素Fe（Ⅱ）不 容易被氧化。
同样是血红素，与不同的蛋白质结合后，具有不 同的功能，如在细胞色素C中，血红素起可逆电子
载体的作用，过氧化氢酶中，血红素催化H2O2歧 化成H2O和O2 。
在血红素结合O2的一侧，还有一个His残基，即 第64（或E7）位His残基，称为远侧His。由于这 个远侧His的存在，使得O2的结合受到空间位阻。 在氧合肌红蛋白中， O2的两个原子与Fe不成一条直 线，而是倾斜了30°。
第六页，共96页。
远侧His
近侧His
第七页，共96页。
6
铁氧
离合
子肌
的红
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肌红蛋白血红素
Fe原子的位移
肌红蛋白血红素在没有与O2结合时，铁原子 是向第 5 配位体方向（His F8）突出的。当与 O2结合时，铁原子被拉回到卟啉平面。
第十一页，共96页。
原肌 子红 的蛋 位白 移血
红 素
第十二页，共96页。
Fe
肌红蛋白结合氧的定量分析
肌红蛋白与O2结合的反应式为 MbO2
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血红蛋白的三维结构
β2
β1
α2
第二十七页，共96页。
α1
Hb的α链、β链和Mb链构象 的相似性
血红蛋白α链、β链及肌红蛋白链的三级结构 非常相似，但这三种肽链的氨基酸序列有很大不 同，141个氨基酸残基位置中只有27个位置的残基在
这三种肽链中是相同的。
Mb
Hbα
第二十八页，共96页。
第四十二页，共96页。
2,3-二磷酸甘油酸