纤维素酶的组成

生化实验报告 1 山东大学实验报告 2011年4月20日 姓名 张行润 系年级 2009级生科4班 学号 200900140177 同组者 于潜 科目 生物化学实验 题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法 仪器编号 105 一、 实验目的 1、 学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、 巩固使用分光光度计 二、 实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、 实验器材 （1）722型分光光度计 （2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平 （7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10） （10）移液管 （2mL；5mL） （11）烧杯 （500mL×3） （12）洗耳球 四、 实验材料 （1） 纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2） 3、5—二硝基水杨酸显色液； （3） 0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置； （4） 标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5） 蒸馏水。 五、 实验操作 1. 空白管的测定： 生化实验报告 2 1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC； 2. 样品管测定： 取三支比色管，分别加入0.5%CMC 3毫升，酶液1毫升,混匀后与空白管一起于50℃水浴锅中水浴30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加蒸馏水定容至25毫升，混匀，与标准曲线同时于550nm处测OD值。 3. 标准曲线绘制： 取6只25ml比色管，分别吸取0，0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于,6支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml。在550nm处比色测其OD值。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。 4. 计算酶活力： 在上述条件下，每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。 N ×OD值对应的葡萄糖量 纤维素酶活力单位＝——————————— `30×1 N---酶液的稀释倍数 30――糖化所用时间 １――反应酶液毫升数 六、 注意事项 1. 实验中由于比色管中溶液量过多，若用旋窝搅拌器混匀，可能使溶液溅出，可使用保鲜膜，将其覆盖在比色管口，上下摇动比色管，进行混匀； 2. 分光光度计使用前应进行预热30min，使其发光稳定，且在无样品放置时，应使试样室盖打开，此时光门自动关闭，以保护光电管； 3. 使用比色管时要将其擦拭干净，应用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸擦拭，以避免对比色管光滑一面造成磨损。且测量时，不可以其磨砂面正对光源； 4. 在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对高浓度待测液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到低浓测定，则需要对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影响。 七、 实验结果 (一) 实验数据统计 表一 标准曲线的测定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 显色液/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水定容至25mL A(550nm) 0.000 0.105 0.224 0.345 0.462 0.583 生化实验报告 3 样品的测定 编号 空白 样品一 样品二 样品三 酶液/mL 1(失活) 1 1 1 CMC/mL 3 3 3 3 50℃恒温30min 显色液/mL 3 3 3 3 沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水至25mL A(550nm) 0.000 0．429 0.433 0.428 (二) 图表分析

纤维素合酶的结构及细胞壁中纤维素的合成过程（综述）

莫文洲

(中国农业大学农学与生物技术学院植物108，1001080823)

摘要：纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源，，植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶，本文综述了从蛋白结构和基因组成上总结了纤维素合酶的特点以及植物细胞壁中纤维素合成的过程。

关键词：纤维素合酶 纤维素的合成

纤维素是地球上数量最多的有机大分子物质，是构成细胞壁的基础物质，占初生细胞壁物质的20%~30%。纤维素分子是由β（1-4）连接的D-葡聚糖组成的高分子聚合物，并通过分子内氢键使其形成一种类螺旋状的结构。随着社会的快速发展，人类对植物纤维的需求激增，而过度利用自然界的植物纤维资源将对人类生存造成极大的破坏。植物纤维素生物合成机制的研究对材质改良，木材定向培育以及农业、造纸等化工业都十分重要。而纤维素主要有纤维素合酶来合成，所以对植物纤维素台酶基因及其蛋白的研究显得更有价值。要掌握纤维素合成酶基因的调控。

1.纤维素合酶的结构

1.1纤维素合酶蛋白结构特点

在不同植物的纤维素合成中，不同的纤维素合成酶(CesA)基因的具体作用是不同的，并且在纤维素的生物合成中，需要多个纤维素合成酶基目的共同作用。纤维素的糖基转移酶有两个催化位点。所有的CesA和Csl蛋白都具有跨膜蛋白的特征，在N一端与C一端具2个或多个跨膜区域，其中间为亲水胞内区，CesA与Csl蛋白之间最大的同源性出现在中间胞内区。植物纤维素合成酶的N末端一段氨基酸可形成一个特殊的结构域，类似于锌指状或LIM 转录因子构向，此种该结构域具有保守序列CxxC(半胱氨酸氨一x 半胱氨酸氨)，与蛋白间的相互作用有关。

其次，植物纤维素合成酶包含有2个高变区，其中一个在N端，约150个氨基酸残基，富含酸性氨基酸，另一个在A 区与B区之间，约5O个氨基酸。A 区和B区是植物纤维素合成酶基因所特有的保守区，A 区含有几个保守的天冬氨酸残基，排列特征为Dx⋯xDxD(D为天冬氨酸)。B区除含有一个保守的天冬氨酸残基外，还有另一个序列QxxRw。A 区可结合纤维素合成的底物：尿苷二磷酸一葡萄糖，而B区则与纤维素合成酶的催化活性有关。 第三，纤维素合酶共有8个跨膜区，其中有两个在N一末端，另外6个在C一末端。N端和C端跨膜结构域之间约有550个氨基酸长度的间隔，具有典型的亲水性，可形成环状结构延伸至细胞质，称为胞内区。跨膜区是 β—1，4-葡萄糖苷链穿过质膜进入细胞壁的重要通道。

纤维素酶 水解作用 机制

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纤维素酶由三类组成1)内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-

1-4,也称EG酶或Cx酶);(2)外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-1-91),又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)或C1酶;(3)β-葡萄糖苷酶

(β-glucosidase,EC3-2-1-21),简称BG。

纤维素酶解是一个复杂的过程,其最大特点是协同作用。内切葡聚糖酶首先作用于微纤维素的无定型区,随机水解β-1,4-糖苷键,产生大量带非还原性末端

的小分子纤维素,外切葡聚糖酶从这些非还原性末端上依次水解β-1,4糖苷键,

生成纤维二糖及其它低分子纤维糊精,在β-葡萄糖苷酶作用下水解成葡萄糖分

子。这种协同作用普遍存在,除了上述协同作用,还可以发生在内切酶之间,外切

酶之间,甚至发生在不同菌源的内切酶与外切酶之间。一般地说,协同作用与酶解底物的结晶度成正比。

纤维素酶优先作用于纤维素的无定形区域,对结晶纤维素有一定的降解,但

难度较大"值得庆幸的是,通过研究,我们对结晶纤维素降解的作用机制已有了一

定的认识在纤维素酶解的最初阶段,EG和CBH能引起纤维素的分散化和脱纤化,使纤维素结晶结构被打乱导致变性,纤维素酶深入到纤维素分子界面之间,使其

孔壁!腔壁和微裂隙壁的压力增大,水分子介入其中,破坏纤维素分子之间的氢键,

产生部分可溶性的微结晶。

纤维素酶中单个组分的作用机制与溶菌酶相似,遵循双置换机制。

2影响纤维素水解的主要因素

2.1酶复合物的组分及其比例微生物产生的纤维素酶复合物不一定都有前述三类酶,而是因种类不同,差异较大。酶复合物的组分及其比例决定了它对纤

维素的水解程度,组分较齐,比例适当的酶复合物对纤维素的水解能力较强。以

研究得较多的菌种为例,丝状真菌能产生大量的纤维素酶(20g/L),三类酶都有,

而且比例适当,一般不聚集形成多酶复合体,能降解无定纤维素和结晶纤维素。

纤维素酶在食品工业中的应用

随着人们对食品安全、营养、健康和美味的日益重视，食品已经不仅仅只是满足人们生存的基本需求品，食品工业正在向着更安全、营养及美味的方向发展。

因此，酶作为一种高效生物催化剂，正以它独特的优势代替传统的化学制剂，越来越广泛地应用在食品工业。酶工业已成为我国最具发展潜力的新兴产业之一。

01PART概述

纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶来源非常广泛，除了真菌外，各种原生动物、圆虫类、软体动物、蚯蚓、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌以及放线菌等都能产生纤维素酶。

02PART纤维素酶的应用

1.酱油酿造的应用

酱油是大豆蛋白酶水解产物。酱油酿造主要是利用蛋白酶和淀粉酶等酶类对原料进行酶解，若再使用纤维素酶，可使大豆等原料的细胞膜膨胀、软化、被破坏，使包藏在细胞中的蛋白质、碳水化合物释放，这样就可以缩短酿造时间，提高产率，提高产品的品质，使产品的氨基酸还原糖含量增加。

2.啤酒生产的应用

在啤酒生产过程中，使用纤维素酶后，可将淀粉和纤维素转化为糖，然后经酵母分解全部转化为酒精，出酒率可提高3%~5%，淀粉和纤维素利用率高达90%。利用纤维素酶水解啤酒糟，将酶解液和残渣分别进行有效利用，可大大提高啤酒糟的经济效益和环境效益。

3.果蔬加工的应用

在果蔬加工过程中，为了使植物组织软化膨润，一般采用加热蒸煮、酸碱处理等方法，会造成果蔬的香味和维生素损失。用纤维素酶进行果蔬处理可避免上述缺点，同时可使植物组织软化膨松，从而提高其可消化性并改良口感。

4.茶叶加工的应用

速溶茶传统的生产工艺是采用沸水浸泡茶叶以提取茶叶细胞中的有效成分，如氨基酸、糖、咖啡因、皂甙、茶多酚、茶香成分及色素等，再经低温冷冻干燥。若用纤维素酶先对茶叶进行适当处理，既可降低固定化产酶温度，缩短抽提时间，提高速溶茶的品味，又可提高得率。

5.油料作物加工的应用

纤维素酶在油料作物加工中也起着非常重要的作用。传统上一直采用压榨法或有机溶剂法生产油类产品，其产品质量差、产量低、操作时间长，同时不可避免有机溶剂残留。