叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定
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鱼类病原微生物的检测方法鱼类病原体的检测方法很多,本文介绍了传统的方法:直接培养法、组织切片观察法;免疫学检测方法:单克隆抗体检测、免疫荧光技术、酶联免疫吸附(ELIST)技术;分子生物学检测技术;PCR(聚合酶链反应)技术、核酸杂交技术。
新的检测方法的应用,为水产养殖病原体检测,以及疾病防治等带来了技术革命,并显示出巨大的潜力。
1 传统检测方法1.1 组织切片观察法选择待检测鱼体病灶处作组织切片,在显微镜下观察,以此检测病原。
一般准确性较差,并且较小的病原体检测困难。
1.2 选择性培养法选择性培养基就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基,其功能是使混合菌样中的劣势菌种变成优势菌,从而提高该菌的筛选效率。
这种培养基是在上世纪末由荷兰的M.W.Beijerinck和俄国的S.N.Vinogradsky发明的。
由于选择性培养基制作费用低,使用方便,因此国外常将其作为日常诊断的主要方法。
例如用EIM培养基可识别斑点叉尾鮰的肠杆菌。
在25℃培养48h,EIM培养基能抑制多数鱼类病原菌、真菌和病毒生长,而使Eictaturi菌落呈绿色,半透明,直径0.5—1.0mm,其它菌落则呈褐色、红色、黄绿色、褐绿色,直径大于2mm。
Rimler-shotts培养基则可用来检测腐皮病病原嗜水气单胞杆菌,37℃培养20-24h 可使嗜水气单胞杆菌菌落呈黄色,其它菌落则呈现另外的颜色。
使用选择性培养基时,温度和时间很重要。
同是使用Rider-shotts培养基37℃和37℃以下培养,检测出呈黄色的菌落分别为嗜水气单胞杆菌和杀鲑气单胞杆菌。
这种方法简单、实用,但培养时间还是过长。
另外它只能粗略检测,不能做到精确,要确切鉴别,还要通过免疫学等的检测方法加以确定。
2 免疫学检测方法2.1 单克隆抗体方法单克隆抗体,是一个抗体产生的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生杂交瘤细胞,经无性繁殖的细胞群所产生的。
鱼病的检查和诊断鱼病的检查和诊断一、现场调查(一)了解鱼出现的各种异常现象鱼生病后,不仅在病鱼体表或体内出现各种病状,同时,在水中也会表现出各种异常现象。
如全身发黑、离群独游;在气候、水温等一切正常的情况下,鱼的摄食量突然急剧下降等。
鱼病发生往往有急性型和慢性型。
急性型鱼病,病鱼一般在体色、外观和体质上与正常鱼差别不大,仅病变部位稍有变化,但一经出现死亡,死亡率急剧上升。
而慢性型鱼病,则往往体质消瘦、活动缓慢、体色发黑、离群独游,死亡率一般呈缓慢上升趋势。
鱼类受到寄生虫侵袭时,往往出现焦躁不安。
如鱼鲺侵袭,鱼的体色等变化不大,但鱼出现上跳下窜,阵性狂游。
当鲢碘泡虫侵袭时,鱼的尾部上翘露出水面,在水中狂游乱窜打圈子。
因水体受到污染(重金属污染)造成鱼类中毒时,鱼会出现跳跃和冲撞现象,一般在较短时间内就转入麻痹甚至死亡。
由寄生虫引起的死亡,一般是缓慢的逐渐增加,除集约化养殖发现指环虫、三代虫的侵袭在短期内造成大批死亡外,家庭水族箱养鱼死亡率一般不会太大;可是若遇鱼类中毒,则往往在极短的时间内,出现大批鱼类死亡,而且不分品种,清道夫等都毫不例外地死亡。
因此,及时观察鱼的活动情况对于鱼病的及时诊断和处理具有至关重要的意义。
(二)了解水质和环境情况水温与鱼病的流行有密切的关系,各种病原体都有其繁育生长的最佳温度范围。
很多致病菌和病毒在平均水温25℃左右时,毒力显著增高,水温降到20℃以下时,则毒力减弱,使病情减弱或停止。
斜管虫适宜在水温12~18C时大量繁殖。
小瓜虫生长和繁殖的水温,一般在15~25C,当水温低于10C以下或高于26℃时,则停止发育。
观察水的颜色,对水质情况也可作一大致了解。
水中腐殖质多时,水呈褐色;水中含钙质多时,呈现天蓝色;微囊藻大量繁殖时,水呈铜绿色;城市排出的生活污水,一般呈黑色;当水源被污染时,因污水种类和性质不同而出现不同的颜色,如红、黑、灰白色等,透明度也会随之大大降低。
水中的溶解氧、硫化氢、ph值、氯化物、硫化物等与鱼病流行的关系极为密切。
鱼病的正确检查和诊断办法作者:李荣丰来源:《渔业致富指南》 2017年第16期鱼病的种类很多,引起鱼病的原因也很复杂,为了有效地防治鱼病,必须对池塘环境进行调查,同时对疾病进行正确地检查和诊断才能对病下药,这是能否收到效果的关键。
调查和诊断鱼病常用步骤如下:一、现场调查水环境的好坏,对饲养鱼类有直接的影响。
除因病原体、敌害等的感染和侵袭,引起发病和死亡外,还有周围环境以及水体物理、化学性质的恶化对鱼类的影响也是很重要的。
1. 了解病鱼在池中出现的各种异常现象。
鱼病发生的过程,有急性和慢性等类型。
急性型鱼病,病鱼一般在体色、外观和体质上与正常鱼差别不大,仅在病变部位稍有变化,但一旦出现死亡,死亡率随即急剧上升,常在短期内出现死亡高峰。
而慢性型的病鱼则往往体色变黑,体质瘦弱,离群独游,活动缓慢,死亡率一般是缓慢地逐渐地上升,在长时间内死亡高峰不明显。
鱼类受到寄生虫侵袭和刺激,往往出现不安状态,如鱼受到鲺侵袭后,虽体色和体质变化不大,但表现为上窜下跳,不时急剧狂游;受鲢碘虫侵袭的白鲢,尾部上翘,鱼在水中狂游乱窜,抽搐着打圈子;受到鲢中华鳋侵袭的鲢鳙鱼的尾鳍上叶往往露出水面,在水体表层打转或狂游。
当鱼类因农药或工业废水中毒时,也会出现兴奋、跳跃和冲撞现象,而后转入麻痹阶段。
由上述寄生虫引起的死亡,一般是缓慢地逐渐增加,总的死亡率一般不会太大,若是鱼类中毒,则往往在较短的时间内出现大批死亡,各种家鱼、野杂鱼都不例外。
因此,到现场详细了解池鱼种种表现和周围环境情况,是正确诊断鱼病的首要环节。
2 . 了解池水的物理和化学状况。
水温的高低和鱼病的流行有密切关系,大多数的菌毒性鱼病和寄生虫病都是在水温较高的情况下发生,如一些致病菌和病毒在平均水温25℃左右时,毒力显著增高,当水温降到18℃以下时,毒力减弱,流行病逐渐停止。
但也有的寄生虫适宜于在较低水温中生活。
如斜管虫适宜在12~19℃时大量繁殖。
纯净的水是透明无色的,但由于对光线有选择性吸收作用,同时水中有溶解的或悬浮的物质,光线透入水中时,有一部分的光线被吸收了,有一部分被反射出来,便呈现出各种颜色,水中腐殖质多时,水呈蓝褐色,水中含钙质多有机物少时,水呈天青色。
斑点叉尾鮰主要疾病一、病毒性疾病斑点叉尾鮰疱疹病毒病引起这种疾病的病原为斑点叉尾鮰疱疹病毒(channel catfish herpesvirus, CCHV),该病毒属疱疹病毒科疱疹病毒。
病毒有囊膜,对乙醚、氯仿、酸、热敏感,在甘油中失去感染力。
在25℃的池水中病毒能生存2天,在池底淤泥中会迅速失活。
细胞培养病毒的适宜温度为25~30℃。
患这种疾病的病鱼皮肤及鳍条基部出血,腹部膨大、腹水增多、淡黄色,鳃丝苍白或出血,一侧或两侧眼球突出,病鱼头朝上垂直悬于水中,或呈旋转游动,解剖检查,肌肉、肝、肾、脾等组织有出血区,脾脏往往色浅呈红色、肿大,胃膨大,有粘液分泌物,肠灰白色无食物等病理状态。
该病20世纪60年代在美国最先发现。
在我国大多数养殖斑点叉尾鮰的地区都曾受到过这种疾病的危害。
自然发病主要危害10厘米以下的斑点叉尾鮰鱼苗和鱼种,3~4月龄的斑点叉尾鮰也可发此疾病。
当饲养水温在25~30℃时呈现疾病流行高峰,病程比较短,大约3~7天,死亡率可以达到90%以上。
在水温20~25℃时,发病与死亡率均趋于下降,有研究者的观察结果证明,当饲养水温为19℃时,由此病导致斑点叉尾鮰的死亡率最高可以达到14%,而当水温在15℃以下时,病鱼的症状就不明显,也无死亡现象发生。
该病毒主要通过鱼体接触和疫水而发生水平传播,带毒成鱼是其传染源;同时,现在的研究结果已经证明这种病毒还可以经受精卵而发生所谓的垂直传播。
对于斑点叉尾鮰的这种疾病可以根据病鱼规格、症状、病变和流行季节的特点做出初步诊断。
将病鱼脏器与肌肉做成除菌匀浆液,经注射途径接种健康鱼种可使之发病死亡;或者将该液接种敏感细胞,接种后2天左右出现细胞病变效应(CPE)者、或者利用电子显微镜观察到CCHV粒子,就可以对该疾病作为准确诊断。
对这种疾病目前尚无渔用药物进行有效的治疗,主要依靠预防措施,如:①引进鱼苗和鱼种时严格实施检疫,避免引进带有病毒的斑点叉尾鮰;②加强饲养管理,保持良好饲养水质,控制斑点叉尾鮰苗种的放养密度,在网箱中饲养成鱼的放养密度一般应不高于15尾/米3;③在水温比较高时,不要拉网作业,不要运输鱼种等。
斗鱼常见疾病诊断和治疗夹尾表现:斗鱼的鳍(尾鳍为主)像被胶水粘起来一样无法打开)病因:由于水质差或新水刺激过强(PH值震荡温度变化过大)引起鱼体不适的一种表现形式治疗方法:升温2度+少量大粒盐+每日串养好的新水4分之1 预防方法:保持水质清洁,定期换水,加强对新水的处理,以防止鱼出现不适的反应烧尾烂鳍是斗鱼的常见病啦,本人曾被这两种鱼病困扰很久。
表现:斗鱼的鳍(尾鳍为主)像被什么东西吃掉啦一样烧尾病因:最初由水过酸(PH值过低)过老引起,后来可能会并发细菌性烂鳍治疗方法:首先稳定水质,并下杀菌水或黄粉以预防伤口感染,增加蛋白质含量较高的饲料,一般鱼鳍都会再长出来预防方法:保持水质清洁,定期换水烂鳍针洞病因:细菌性烂鳍针洞:由于水太老引起的水中细菌大量繁殖或鱼鳍受伤引起的伤口感染治疗方法:升温2度+黄粉或杀菌水类细菌性治疗药物,2-3天后换水补药预防方法:保持水质清洁,定期换水寄生虫性:车轮虫寄生治疗方法:低浓度敌百虫或硝酸亚贡药浴预防方法:活食消毒加强对水的处理能力,降低寄生虫入侵的几率胡椒病表现:鱼体出现很多微小的白色小点,鱼的体色精神状态不佳还有夹尾现象出现病因:长期水质不良治疗方法:换一半新水+温度提升到30度+下重盐,2-3天基本可以痊愈预防方法:还是注意水质肠炎表现:食欲不振白便病因:分细菌性寄生虫性两种治疗方法:仔细观察白便是中空的还是实心的中空的用百必除治疗,并下杀内寄药饵实心的用(停食,升温2度,土霉素100升水3片+痢特灵100升水放6片,2天后换水补药)这个方法治疗预防方法:对饲料把关,做好消毒处理白点表现:状态不佳身上有白色小颗粒附着病因:小瓜虫寄生鱼体治疗方法:病鱼隔离+温度30度+大粒盐(也可用硝酸亚贡或其他专杀药物药浴)预防方法:增强对水的处理,降低寄生虫入侵的几率腹水表现:肚子肿胀,后期会有立鳞表现病因+治疗方法:腹水有三种因水质食物带菌引起的内部细菌性疾病,初期用庆大或呋喃唑酮+土霉素辅以镁盐或是大蒜素治疗有百分之六十可能性痊愈因内部寄生虫引起,比较难治,用百必除治疗有一线生机自身缺陷引起的病变(像人类的癌症),没有治疗的可能此病中后期会变为腹水立鳞并发,所以尽早治疗,不过个人认为预防比治疗更重要,平时注意水质情况,勤换水,对食物做早期预防处理预防方法:定期换水以控制细菌繁殖速度,对饲料进行处理,最好多喂杀菌冷冻红虫丰年虾等安全饲料,人工饲料也可以水霉表现:鱼体表面出现絮状物,仔细看可以看到菌丝病因:水霉真菌感染,病鱼的伤口较容易感染水霉治疗方法:建议用专杀药物治疗,推荐德龙霉菌治疗剂,效果奇好,甲基蓝+大粒盐也可以预防方法:水水水还是水白头白嘴表现:病鱼头部颜色消退变为乳白色,嘴部肿胀,有时会出现类似水霉的絮状物病因:目前没有完全查明,应属革兰氏阴性杆菌治疗方法:使用强效杀菌药物,如黄粉+土霉素或特灭菌治疗预防方法:注意水质。
鱼病的诊断方法(转自百度贴吧)前言:诊断鱼病是防治的兽药步骤,只有先确定鱼患的病是什么,然后进行治疗,才能对症下药,取得治疗的效果。
因此能否正确诊断鱼病,是防治的一个关键问题。
诊断鱼病可以从两个方面进行。
一、鱼体检查肉眼检查是检查鱼病最主要的方法,是从鱼患病部位找出病原体,或由病原体引起的反应或症状而表现的各种现象,即病状,为诊断防治鱼病提供依据。
按照病原体的类别来说,鱼病可分为细菌性和寄生虫性两大类。
检查时,一些大型的寄生虫(如蠕虫、甲壳动物、体型较大的原生虫、水霉等),用肉眼可以看到。
不过有一些病原体(如细菌、体型较小的寄生虫),用肉眼是看不到的。
就要根据病状来鉴别。
一般细菌性鱼病,常表现出充血、发炎、脓肿、腐烂、竖鳞等病症;而寄生虫性鱼病,常表现为粘液过多、出血、有胞囊等病症。
由于各种病原体对鱼体所引起的症状不同,这些不同的病症就为我们诊断鱼病提供了有力的证据和有利的条件。
对鱼体要检查部位,包括体表、鳃等两部分。
顺序和方法如下:(1)体表:从缸中捞出病鱼或新死的鱼,放在小脸盆或小玻璃缸中。
按顺序从头部、嘴部、眼睛、鳃盖、鳞片、鳍条等仔细观察。
在体表的一些大型病原体(水霉、线虫、锚头虱、鱼虱、钩介幼虫等)都很容易看到。
但有些用肉眼看不到的小型病原体,则要根据表现出来的病症来鉴别。
如车轮虫、口丝虫、斜管虫、三代虫一般会引起分泌大量粘液,或者头、嘴、鳍条等末端腐烂。
复口吸虫病,则会眼睛浑浊甚至掉落。
赤皮病,则鳞片脱落,皮肤充血等等。
(2)鳃部:鳃部检查重点是鳃丝。
首先要注意鳃盖是否张开,表皮有无腐烂或透明现象。
鳃片颜色是否正常,粘液是否较多,末端是否肿大或腐烂?如是细菌烂鳃,则末端腐烂,粘液较多鳃霉病,则鳃片颜色比正常鱼颜色要白,略带血红色的小点;如是口丝虫、隐鞭虫、车轮虫、斜管虫、三代虫、碘泡虫等鳃部寄生虫疾病,则鳃片上有粘液或者鳃丝肿大,鳃盖胀开。
二、了解水质变化水的酸碱度和溶氧变化也是造成鱼病原因之一。
鱼类疾病的检验和诊断方法一、疾病的诊断依据目前,尚难于做到通过检测患病鱼体的各项生理指标而对鱼类疾病进行诊断,大多只能通过病鱼的症状和显微镜检查的结果作出确诊。
大致可以根据以下几条原则进行鱼病的诊断:1、判断是否由于病原体引起的疾病有些鱼类出现不正常的现象,并非是由于传染性或者寄生性病原体引起的,可能是由于水体中溶氧量低导致的鱼体缺氧、各种有毒物质导致的鱼体中毒等。
这些非病原体导致的鱼体不正常或者死亡现象,通常都具有明显不同的症状:(1)因为饲养在同一水体的鱼类受到来自环境的应激性刺激是大致相同的,鱼体对相同应激性因子的反应也是相同的,因此,鱼体表现出的症状比较相似,病理发展进程也比较一致。
(2)某些有毒物质引起鱼类的慢性中毒外,非病原体引起的鱼类疾病,往往会在短时间内出现大批鱼类失常甚至死亡。
(3)查明患病原因后,立即采取适当措施,症状可能很快消除,通常都不需要进行长时间治疗。
2、依据疾病发生的季节因为各种病原体的繁殖和生长均需要适宜的温度,而饲养水温的变化与季节有关。
所以,鱼类疾病的发生大多具有明显的季节性,适宜于低温条件下繁殖与生长的病原体引起的疾病大多发生在冬季,而适宜于较高水温的病原体引起的疾病大多发生在夏季。
3、依据患病鱼体的外部症状和游动状况虽然多种传染性疾病均可以导致鱼类出现相似的外部症状,但是,不同疾病的症状也具有不同之处,而且患有不同疾病的鱼类也可能表现出特有的游泳状态。
如鳃部患病的鱼类一般均会出现浮头的现象,而当鱼体上有寄生虫寄生时,就会出现鱼体挤擦和时而狂游的现象。
4、依据鱼类的种类和发育阶段因为各种病原体对所寄生的对象具有选择性,而处于不同发育阶段的各种鱼类由于其生长环境、形态特征和体内化学物质的组成等均有所不同,对不同病原体的感受性也不一样。
所以,鲫或者鲤的有些常见疾病,就不会在冷水鱼的饲养过程中发生,有些疾病在幼鱼中容易发生,而在成鱼阶段就不会出现了。
5、依据疾病发生的地区特征由于不同地区的水源、地理环境、气候条件以及微生态环境均有所不同,导致不同地区的病原区系也有所不同。
叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定刘怡南;彭爽;王虹;陈德芳;贺扬;周毅;耿毅【摘要】为确诊叉尾斗鱼肉瘤病,采集自然患病鱼进行病理学观察,基于淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因采用PCR方法对肉瘤状增生物进行检测和进化树分析.结果显示,患病叉尾斗鱼肉瘤状增生物是由大量囊肿细胞聚集在皮肤和鳍条上形成,鳃、肝、肾、脾、肠等内脏组织器官均未观察到囊肿细胞.囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9~1823.8倍,细胞核不规则,细胞质内可见嗜碱性包涵体;透射电镜观察可见囊肿细胞胞质内存在大量直径约171.5 nm的病毒粒子.病理观察结果符合鱼类淋巴囊肿病毒感染的临床特征,PCR方法检测到1272 bp的目的片段,测序结果显示,该基因与GenBank中的淋巴囊肿病毒K J408271.1序列相似性达99%.试验结果表明,叉尾斗鱼肉瘤病为淋巴囊肿病毒感染所致,皮肤和鳍是病毒感染的靶器官.本研究为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供了试验参考.【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2018(037)005【总页数】5页(P679-683)【关键词】叉尾斗鱼;肉瘤病;淋巴囊肿病毒;病理;诊断【作者】刘怡南;彭爽;王虹;陈德芳;贺扬;周毅;耿毅【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学生命科学学院,四川雅安625014;四川农业大学动物医学院,四川成都611130【正文语种】中文【中图分类】S941.1叉尾斗鱼(Macropodus opercularis)属鲈形目、攀鲈亚目、丝足鲈科,为小型淡水观赏鱼类;其色彩艳丽、体形优美,备受各国观赏鱼爱好者追捧,被誉为“天堂鱼”[1]。
叉尾斗鱼肉瘤病是养殖过程中出现的一种慢性皮肤瘤,主要症状为患病鱼的头部、躯干和鳍条聚集出现成串或成团的白色半透明状囊肿物;该病不会导致鱼类大规模死亡,但会严重影响观赏价值。
1975年澳大利亚学者最早描述了叉尾斗鱼体表出现的“覆盆子样”增生物,报道指出其具有典型的淋巴囊肿细胞结构[2]。
虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus)被认为是鱼类淋巴囊肿病的病原,其可感染全球范围内超过125种硬骨鱼类,引起鱼类浅表组织出现慢性增生性囊肿,疾病给水产养殖业造成巨大经济损失[3]。
在我国,养殖鱼类云纹石斑鱼(Epinehelus moara)[4]和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[5-6]是淋巴囊肿病毒的易感宿主;2014年Xu等[7]研究证实虹彩病毒科淋巴囊肿病毒也是叉尾斗鱼重要的病原。
2015—2016年四川某观赏鱼店先后多批自广东购进的叉尾斗鱼体表均出现肉瘤状增生物,疑似为淋巴囊肿病毒感染。
为确定病原,笔者收集患肉瘤病病鱼,进行了病理学检测和增生物主要衣壳蛋白基因序列分析,为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供基础资料。
1 材料与方法1.1 试验材料患病叉尾斗鱼体长5~10 cm,8~12月龄,购自广东惠州某斗鱼养殖场;DNA 提取试剂盒购自QIAGEN公司;D2000 Marker和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 病理学观察采用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉患病鱼致死,体表病变观察并剖检,记录病理变化并拍照。
1.3 组织病理学观察采集皮肤、鳃、心、肝、脾、肾、脑和肠组织,室温固定于4%多聚甲醛中,常规石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色,光学显微镜观察增生物形态和组织病理变化,并拍照,Image-Pro Plus 6.0用于细胞大小测定。
1.4 组织透射电镜观察取皮肤体表肉瘤状增生物,固定于2.5%戊二醛,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸铀—枸橼酸铅双染色透射电镜观察病毒形态,并拍照。
1.5 淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因检测以肉瘤样增生组织中的基因组DNA为模板,利用淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因引物MCP-F(5′-ATGACTTCTGTAGCGGGTTCAAGTG-3′)和MCP-R(5′-CTAAAGTACAGGAAATCCCATTGAAC-3′)进行PCR扩增[7]。
反应条件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 45 s,48 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃ 2 min。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的片段送上海生物工程有限公司测序。
测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLSAT比对分析,采用Mega 4.1构建进化树。
2 结果2.1 病变观察体表肉瘤状增生物呈白色或灰白色,半透明球形小颗粒状,单个成片或堆积成团,集中分布在患病鱼的背鳍、臀鳍、尾鳍及鳍条基部区域(图1a)。
增生物早期主要散布于鳍条上,逐渐增多堆积成团伴有鳍条充血(图1b),严重时出现蛀鳍,增生物成片扩散蔓延至体表,鱼体体色明显变淡(图1c)。
解剖观察,鳃丝轻微肿胀,内脏未见明显异常。
2.2 组织病理观察体表肉瘤状增生物是由大量直径约48.7~217.8 μm(n=11)的囊肿细胞聚集形成。
皮肤上大小不等的球形囊肿细胞相互挤压堆积出现在真皮层,囊肿细胞间有大量浸润的炎性细胞和增生的上皮细胞,真皮层中黑素细胞聚集减少,而皮下肌肉组织结构清晰、肌细胞排列整齐无明显病变(图2a)。
鳃丝肿胀增厚,鳃小片呼吸上皮浮离,基底黏液细胞增多,炎性细胞浸润(图2b)。
脾脏出血,白髓区域减小(图2c)。
其他组织器官无明显病变。
图1 体表病变a.对照(上),鳍条感染(中),体表感染(下);b:鳍条充血;c:蛀鳍. 图2 组织病理变化a.皮肤;b:鳃丝;c:脾脏. E: 表皮;D: 真皮;M: 肌肉;PL:鳃丝;Epc: 呼吸上皮;Mc: 黏液细胞;Ⅰ:脾脏出血;Ⅱ:白髓减少.囊肿细胞仅出现在皮肤和鳍条上,在鳃、脾、肠、肝、肾等内脏组织中均未观察到囊肿样异常肥大细胞。
正常细胞直径为5.1~6.4 μm,囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9~1823.8倍(按面积计算)。
典型的囊肿细胞核深染位于细胞一侧,染色质成团聚集;细胞质边缘有大量网状嗜碱性包涵体,细胞膜为均质透明细带状(图3a);膜外单层毛细血管包裹滋养着感染阶段的囊肿细胞(图3b),衰老的囊肿细胞缩小,细胞膜均质变厚,破裂,胞内物质降解(图3c)。
2.3 透射电镜观察体表肉瘤状增生物在透射电镜下可观察到大量形态一致的病毒粒子分布于囊肿细胞胞质内,直径约(171.5±1.2) nm,具有衣壳,切面呈六边形对称结构(图4)。
图3 囊肿细胞的显微结构a.典型囊肿细胞;b:感染阶段细胞;c:降解阶段细胞. N:细胞核; I: 胞质包涵体; H: 透明被膜; C: 毛细血管; M: 黑素细胞; IE: 炎症上皮样细胞; D: 降解细胞.图4 透射电子显微镜观察a.17 000×; b:40 000×.2.4 病毒检测及发育树分析以肉瘤状增生物组织提取的基因组DNA为模板,采用通用引物对淋巴囊肿病毒基因主要衣壳蛋白基因进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳观察可见在1000~2000 bp 间出现单一条带(图5),回收产物测序获得1272 bp的碱基序列,将序列在美国国立生物技术信息中心数据库中进行Blastn比对,其与淋巴囊肿病毒(登陆号KJ408271.1)主要衣壳蛋白的序列相似性达99%。
与19株不同种属的虹彩病毒进行系统发育树构建,结果表明,感染病毒株属于虹彩病毒科中淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus),明显区别于肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)和蛙病毒属(Ranavirus);其与同为观赏鱼来源的序列KJ4408271.1和AB299163.1聚为一簇,与同为叉尾斗鱼来源的毒株亲缘关系最近(图6)。
图5 PCR扩增结果1.DL2000 Marker; 2:阴性对照; 3、4:增生物样品; 5:DL2000 Marker.图6 基于主要衣壳蛋白基因的系统发育树3 讨论叉尾斗鱼肉瘤病是一种体表慢性皮肤瘤,疾病病程长,虽然死亡率不高,但会使患病鱼丧失观赏价值;随着观赏鱼全球贸易的拓展,以观赏鱼为宿主的病毒性疾病传播对各国疾病诊断和检疫工作提出了新的要求。
本研究对采集的叉尾斗鱼肉瘤病病鱼进行检测,结果显示,体表白色或灰白色、半透明球形颗粒瘤状增生物是由异常肥大的囊肿细胞堆积而成,囊肿细胞是由淋巴囊肿病毒感染所致。
这与报道淋巴囊肿病毒感染形成典型的皮肤浅表增生物相一致[7-8]。
虹彩病毒科分为5个属,其中感染脊椎动物的是蛙病毒属、肿大细胞病毒属和淋巴囊肿病毒属。
病毒主要衣壳蛋白基因被认为是虹彩病毒科内病毒鉴定的理想目的基因。
本试验扩增测序得到1272 bp的主要衣壳蛋白基因片段,在线比对与淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因相似性达99%。
叉尾斗鱼属于脊椎动物硬骨鱼类,早期研究显示,其是虹彩病毒科肿大细胞病毒的易感宿主[9]。
试验系统发育树分析结果显示,感染病毒与肿大细胞病毒明显进化差异,其与淋巴囊肿病毒聚为一簇,且与淋巴囊肿病毒同为斗鱼分离株的KJ408271.1亲缘关系最近,表明叉尾斗鱼肉瘤病病原为淋巴囊肿病毒。
淋巴囊肿病毒广泛分布于天然水体中,是危害鱼类健康的重要病毒性病原之一。
淋巴囊肿病毒与靶细胞膜上受体绑定通过内吞或膜融合方式进入胞内[10];病毒通过抑制靶细胞凋亡和细胞分裂为病毒复制赢得时间,同时刺激细胞聚变促使靶细胞异常肿大[11]。
淋巴囊肿病毒复制在胞质内形成包涵体,病毒DNA和蛋白质在其内装配完成后,脱离包涵体进入胞质,待细胞裂解后释放到组织中。
本试验观察到在异常肥大的囊肿细胞内有大量的嗜碱性包涵体,电镜显示其胞质内含有装配成熟的六边形病毒粒子。
同时,病毒感染可以上调胶原纤维相关基因表达,在感染细胞表面形成透明被膜[11]。
本试验观察到,在囊肿细胞被膜随着病毒的感染增厚,衰老的囊肿细胞虽然细胞缩小,但有的囊膜明显增厚。
此外,在感染阶段典型的囊肿细胞被膜外包裹有单层毛细血管,细胞与细胞间毛细血管丰富,这些血管支持着肿瘤细胞的新陈代谢。
若在疾病治疗中能有效控制囊肿区域局部血液供应,将为肉瘤病的治疗提供新的方法。
淋巴囊肿病毒最主要的靶器官是体表皮肤下的结缔组织,也可感染鳃、脾、体腔膜、肠和头肾等组织器官,褐牙鲆感染可在鱼体表、鳃、肠壁、肝、头肾、脾中观察到囊肿细胞,而花鲈(Lateolabrax japonicus)则仅在鳃上观察到典型囊肿细胞[12]。
本试验仅在皮肤和鳍条观察到典型囊肿细胞,病变细胞局限在真皮层,其他脏器未见典型囊肿细胞或异常肿大细胞,且叉尾斗鱼脏器病变较易感动物褐牙鲆等的病理变化轻微,表明叉尾斗鱼淋巴囊肿病毒感染局限在体表,皮肤和鳍条是其感染的靶器官。