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《分子生物实验技术》PPT课件

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现代分子生物实验技术PPT(上)

现代分子生物实验技术PPT(上)

3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。

分子生物学实验技术ppt课件

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质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建

分子生物学实验技术.pptx

分子生物学实验技术.pptx

DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环 境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、 有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环 境又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌 细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放 出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分 子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中， 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底 部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出 来。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标பைடு நூலகம்基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
Ampr抗性基因
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力
分子生物学实验
目录
实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验四、ＤＮＡ的限制性酶切 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA
的转化 实验六、PCR基因扩增技术
实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定
一、实验目的
• 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提 取方法
P(BLA) ApaLI (2367)
APr
pUC19
2686 bp

分子生物学技术ppt课件

分子生物学技术ppt课件
• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增

分子生物学实验技术_DNA转化

分子生物学实验技术_DNA转化
分子生物学实验技术---DNA转化 转化 分子生物学实验技术
转化：将质粒导入大肠杆菌或其他细胞内 的过程叫转化。 与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细 胞的能力，这种具有接受外源DNA能 力的细胞叫感受态细胞
制备感受态细胞
CaCl2 法
原理：细菌处于0oC,CaCl2的低渗溶液中，菌细 胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNAase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面， 经42oC短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合 物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复 原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因 得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需 的转化子。
电转化法 1.取1ml 37oC 150rpm过夜培养的菌液加入含有 100ml LB液体培养基的三角烧瓶中37oC，培养 2~3h（OD=0.5~0.8） 2.将菌液分装至2个50ml离心管中，冰浴30min 3.4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加入 50ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀（清洗的目 的是去掉细胞溶液里的各种杂质。在高压电的情 况下， 多余的离子将破坏细胞结构 ）
4. 4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别 加入25ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 5. 4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别 加入10ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 10ml 10% 6.4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加 入400ul预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 7.40ul每管分装，4oC保存
电转化
原理：利用瞬间高压使细胞壁产生小孔而接受外 源DNA。操作中需要将DNA溶液中的盐分全部去 掉，否则因盐分而产生高电流，高电流产生火花 而杀死大肠杆菌
实验步骤

《分子生物学》课件

《分子生物学》课件
介绍CRISPR-Cas9系统的原理 及在基因编辑中的应用。
基因编辑实验室
展示现代基因编辑实验室的设 备和技术。
基因治疗
探讨基因编辑技术在治疗遗传 病和癌症中的潜力。
生物信息学与计算生物学
大数据分析
使用生物信息学和计算生物学的工具来分析 海量生物数据。
蛋白质结构预测
通过模拟和计算来预测和研究蛋白质的结构 和功能。
3 基因修复与修复机
制
探讨基因损伤修复和细 胞保护机制在环境暴露 中的作用。
生物多样性与保护
生物多样性
解释生物多样性的重要性和全球生物多样性状 况。
保护生物多样性
讨论保护生物多样性的 分子标记物
液体活检
通过PCR和测序技术检测基因突变和遗传病。
《分子生物学》PPT课件
《分子生物学》PPT课件大纲： 1. 介绍分子生物学概念 2. DNA和RNA结构与功能 3. 蛋白质的合成与结构 4. DNA复制和细胞分裂 5. 基因表达与转录 6. RNA加工修饰 7. 蛋白质翻译和折叠 8. 基因调控及表观遗传学
基因编辑与CRISPR技术
CRISPR Cas9
介绍分子标记物在疾病诊断和治疗中的应用， 如肿瘤标志物。
探讨液体活检在肿瘤诊断和监测中的潜力。
分子生物学的社会影响
1 伦理和法律问题
讨论基因编辑和遗传修 复等技术引发的伦理和 法律问题。
2 公众教育和意识
强调公众了解分子生物 学的重要性和科学素养 的培养。
3 医疗与健康
探讨分子生物学在医疗 和健康领域的革命性发 展。
基因组学研究
利用计算方法研究基因组结构、功能和进化。
网络生物学
通过构建和分析生物网络来揭示生物体内的 复杂关系。

分子生物学实验基本技术


分子生物学实验进程
实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化 实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化 实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR 实验六 Western印迹（上） 实验七 Western印迹（下） 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应 实验十 Northern印迹 实验十一 Southern印迹 考试
1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
段连接起来构成一个新的DNA分子的过程。
分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程。

分子生物学实验技术

3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并 用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用 器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要 灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化 效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
分子生物学实验技术
质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小 从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有 自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数， 并表达所携带的遗传信息。
匀涂在含KA+抗性的LB固体培养板上，待菌液吸收完全后即可； 5. 将涂完的固体培养板倒置放于37 ℃烘箱，培养12-16h，直至单菌 落出现。
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：
1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细 胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情 况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
（目的为洗脱Resin上吸附的蛋白质、盐等杂质），然后重复一次该操作； 9. 空柱12000r/min离心1min，以甩干剩余液体（主要去掉残余乙醇，便于DNA溶解）； 10. 将吸附柱置于 1.5mlEP管内，向吸附膜中央加入50ulddH2O，静置2min后，室温

分子生物学实验基本技术

分子生物学实验基本 技术
汇报人：
目录
分子生物学实验技 术概述
基因克隆和表达技 术
PCR技术和相关技 术
分子杂交和印迹技 术
基因编辑技术
蛋白质技术和蛋白 质组学
分子生物学实验技 术概述
添加标题
定义：分子生物学实验技术是指在分子水平上研究 生物现象和过程的技术，包括基因克隆、基因表达、 基因突变、基因重组等。
蛋白质组学在分子生物学实验中的应用：研究蛋 白质的功能、调控机制和疾病发生机制等
感谢您的观看
汇报人：
PCR技术和相关技 术
原理：通过DNA复制技术，将DNA片段扩增 步骤：包括模板DNA的制备、引物的设计、反应体系的配置、PCR反应的进行等 应用：广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域 相关技术：包括实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR等
原理：逆转录-聚合 酶链反应技术，将 RNA逆转录为cDNA， 再进行PCR扩增
添加标题
Northern印迹技术：用于检测RNA序列，通过电泳将RNA片段分离，然后用放射性标记的探 针进行杂交，最后通过放射自显影检测杂交信号。
添加标题
应用：Southern印迹和Northern印迹技术广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检 测等领域。
添加标题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优缺点：Southern印迹技术灵敏度高，但操作复杂，耗时长；Northern印迹技术操作简单， 但灵敏度较低。
基因编辑技术
应用：广泛应用于基因功能 研究、疾病治疗等领域
原理：利用Cas9蛋白对DNA进 行切割，形成双链断裂，从而 实现基因编辑
优势：操作简便、高效、精 确，可应用于多种生物体
局限性：存在脱靶效应，可 能导致非目标基因的突变

分子生物实验技术

分子生物实验技术
分子生物实验技术是一门涉及分子生物学、生物技术和微生物学的综合性学科，它将理论研究与实际应用相结合，通过多种实验手段来研究生物分子的结构、功能和相互作用关系。

在分子生物实验技术领域，涉及到许多基础实验技术和高级实验技术，如PCR技术、DNA 测序技术、蛋白质电泳技术等，这些技术的应用可以帮助科学家们探究生命现象的本质、寻找新药物和新治疗方案，同时也为现代医学、生物工程、农业科技等领域的发展提供了强有力的支持。

除此之外，分子生物实验技术还涉及到许多新兴的前沿技术，如CRISPR/Cas9基因编辑技术、单细胞分析技术等，这些技术的不断创新和发展将会进一步推动分子生物实验技术领域的进步和发展。

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（3）苯抽提法
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯 酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子 表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于 酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复 操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质， 用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃 漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天 然状态 。
10ml管代替） 8、摇匀Binding Matrix suspension，加1ml到15ml管的上清液中
9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化 合物
10、小心的弃去700ul的上清液 11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到
SpinTM Filter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再 将剩余的混合物加入到SpinTM Filter中，如前操作 12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si 化合物 13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次） 14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新 的无菌离心管中 15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTM Filter 16、小心的加入50~100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合 物湿润，55℃温浴5min 17、13000rpm离心1min，弃去SpinTM Filter，液体保存备用
power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini Kit Omiga 公司 国产试剂盒 按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20℃保存备用
Fast-Prep SPIN Kit（for soil） 操作说明
1、称量500mg土样（离心适量活性污泥）到一个Lysing Matrix E管 中，冰上静置2min。
DNA提取原理
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中 提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA 及 无机离子等，从中分离DNA。
步骤
1、细胞破碎 三种方法 ➢ 机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法； ➢ 化学试剂法：SDS处理； ➢ 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。
环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等
水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微 孔滤膜剪碎，用于提取DNA
土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂 质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处 理去除一部分干扰物质后再提取
具体方法很多：直接提取法、间接提取法
1、水样DNA提取
用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE 充分 震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1ml TE，加20ul 20mg/ml 溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加 1/3体积5M NaCl，剧烈震荡混匀， 12000rpm 离心5min，上清 液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加 0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加 1/10V 3M pH5.2 NaAc后，2.5V 无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤 后溶于50ul TE中，测定A260/A280， A260/A230 确定DNA的纯度和 浓度
（4）水抽提法
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐 溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水 中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至 2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分 别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即 得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不 用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。
DNA提取的几种方法
(1) 浓盐法： A. 利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M
氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使 乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间， 而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。 B. 用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖 蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。 ➢ A/B两种方法比较, B法使核酸降解可能少一些。
A260/A280 : 是衡量蛋白质污染程度的指标，通常在1.7-1.8之 间较好； A260/A230：衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在1.72.0 之间较好。
常用试剂盒品牌
MP Bio公司Fast-Prep SPIN Kit（for soil） Mo Bio公司ultra clean soil DNA kit
2、加978ul的sodium phosphate buffer 到样品管中 3、加122ulMT buffer (保持管中有250~500ul剩余空间） 4、在振荡器中充分振荡混匀 5、13000rpm离心10min 6、将上清液转入到一个新的无菌2ml离心管中，加250ul PPS(蛋白质
沉淀剂），手动混合10次 7、13000rpm离心5min，将上清液转入到一个无菌15ml离心管中（可用
C. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的 分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液 中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5M NaCl，0.015M柠檬酸 钠（并称SSC溶液）提取DNA。
（2）阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提 取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去 污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。
分子生物实验技术原理
污染控制与资源化研究国家重点实验室 20120319
一、DNA提取原理和方法
核酸的理化性质 ：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合 物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解 度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性 溶液中较稳定。