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生物学中的新技术和新方法生物学是一门研究生命的科学，随着科技的发展，越来越多的新技术和新方法被应用于生物学研究中，为我们打开了一扇又一扇的研究之门。
本文将着重介绍几种在生物学中应用广泛的新技术和新方法。
一、 CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于细菌体内天然的防御机制，通过修改Cas9货架蛋白与gRNA的配对，能够精准切割基因组DNA，进而实现基因编辑。
这种技术已经在人类、动物和植物研究中被广泛使用，成为生命科学研究中的一项重要工具。
CRISPR-Cas9技术的应用范围较为广泛，可以用于产生动物模型，如基因敲除小鼠、人类细胞对疾病的研究，以及植物基因组编辑等。
这种技术的精准性高、速度快、成本低廉，具有很大的发展前景。
二、单细胞分析技术单细胞分析技术指从单个细胞开始研究，可以大大提高成果的精度和体现深度，它包括单细胞测序、单细胞质量分析、单细胞代谢分析以及单细胞芯片等。
相比传统的分析方法，这种技术可以识别个体中的细胞异质性，从而发现数据中不同的细胞类型、产生新的发现和解释。
这种技术的应用范围非常广泛，从研究胚胎分化和人体生理学到肿瘤学和免疫学等多个领域都有应用。
单细胞分析技术能够识别和定量不同细胞亚群的表型、基因表达和代谢状态等，为基础、转化和临床研究提供了更深入的认识。
同时也为药物研发提供了更精确的评价方式。
三、人工智能技术人工智能技术是近年来飞速发展的一种技术，在生物学研究中也得到了广泛应用。
人工智能技术可以透过数学模型精确计算大规模数据，将大数据的分析过程提速，有效减少研究人员的时间和工作量，以更高效的方式达到科学目标。
这种新技术也为数据处理和生命科学研究提供了依据。
在计算机视觉和图像分析领域的研究中，人工智能技术已经显示出具有重要作用和前“顾（qí）路”性。
CRISPR-Cas9 技术及CRISPR文库的应用基因编辑技术是指在基因组水平上对目的基因序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或插入外源DNA序列的基因工程技术，经典的基因组编辑技术主要依赖于同源重组及干细胞全能性来完成对个体特定基因的改造。
因为其在生物医学和工农业生产中发挥着重要作用，所以相关的早期开创性工作被授予2007 年诺贝尔生理医学奖。
但是经典的方法存在效率低、技术要求高和成本高等缺点，严重制约了相关的研究和工农业生产。
但是当2013年CRISPR-Cas9系统的诞生，使基因定位、精准修改变得更加容易，CRISPR文库的应用也让基础研究中大规模的基因组编辑和筛选成为现实。
基因定位和精准修改意味着该技术可以人为控制基因表达，目前CRISPR-Cas9基因编辑技术可被广泛地应用于动物模型构建、遗传疾病治疗、农业育种等方面。
动物模型构建CRISPR-Cas9 系统作为最新一代基因编辑技术，能够简便高效地实现基因组精确修饰，是制备哺乳动物疾病模型的重要工具。
目前科学家利用CRISPR-Cas9 技术在动物模型，如小鼠、大鼠、猪和猴等研制方面做出一系列重要工作。
如科学家们将CRISPR-Cas9 系统导入小鼠受精卵，成功获得了有特定基因突变的小鼠模型，并获得近乎100% 的基因靶向突变效率，极大地降低了基因编辑小鼠模型制备的难度和成本，有望被广泛应用。
遗传疾病治疗及药物靶点筛选作为一种简便高效的基因编辑技术，CRISPR-Cas9 技术自问世以来就被认为具有治疗遗传疾病的巨大潜力。
科学家们选择小鼠白内障遗传疾病模型进行研究。
对携带显性突变引发晶状体混浊的Crygc 基因进行定点修正。
发现有1/3 的新生小鼠白内障症状被治愈，并通过生殖细胞将修复的Crygc基因传递到下一代，证明白内障遗传疾病得到了根治。
CRISPR-Cas9技术更大的一项突破是CRISPR文库在药物靶点筛选中的应用。
有科学家通过构建全基因组CRISPR文库，使全基因组中18000个基因形成缺失突变，结合相关的药物筛选手段最终对细胞进行筛选，最终对筛选存活的细胞进行NGS测序，即可推断出药物靶点相关基因。
CRISPR技术在动物基因编辑中的应用CRISPR技术是一种高效、精准的基因编辑技术，它被广泛应用于动物基因组的修饰。
CRISPR技术通过利用CRISPR/Cas9系统对基因组的DNA序列进行切割和编辑，实现了高效、精准且可控的基因组编辑。
近年来，CRISPR/Cas9技术在动物生殖、疾病模型建立、基因功能研究等领域取得了重要进展。
一、CRISPR技术在动物生殖中的应用CRISPR技术在动物生殖中被广泛应用于制造转基因动物。
通过将CRISPR/Cas9系统转染到动物的受精卵中，可以实现对动物基因组的遗传信息进行精细调控。
这种方法被称为“胚胎基因编辑”。
胚胎基因编辑可以对生殖细胞基因组进行编辑，实现精准的遗传性状的修饰。
这项技术将成为将来创造个性化药物和遗传学研究领域的重要基础技术。
同时，CRISPR技术还可以用于人工繁殖技术的应用。
例如，在猪肝脏移植的研究中，科学家发现，通过使用CRISPR技术制造克隆猪，可以获得与人类兼容的移植器官，这将为人类移植器官不足的问题提供更多的解决方案。
二、CRISPR技术在疾病模型建立中的应用CRISPR技术在建立动物疾病模型中也具有重要的应用价值。
通过对基因组进行精确编辑，科学家可以制造出各种不同的基因型动物，包括突变体、敲除体、和人类疾病模型动物等。
这些基因型动物模型被广泛用于研究基因与疾病的关系，探究疾病发生机制以及开发新的治疗方法。
例如，在哺乳动物中，CRISPR技术被广泛应用于基因工程动物的制作，比如敲除某个基因，使它不能表达，观察与病理学相关的表现等。
通过CRISPR技术制造的新型疾病模型动物能够更加准确地反映出人类疾病的发生过程，为人类疾病理解和治疗提供了重要的平台。
三、CRISPR技术在基因功能研究中的应用CRISPR技术被广泛应用于基因功能研究中，因为它可以揭示某个基因在生理、病理过程中的具体作用。
通过敲除或突变一个基因，可以观察该基因在生物学中的具体作用。
CRISPR/Cas9基因编辑技术综述作者：钦越陈志杨章平来源：《河南农业·教育版》2021年第07期摘要：CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现，是适应性免疫系统的一部分，现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达。
同时，CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制，确定药物开发的靶标，并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究。
对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展望，以期为CRISPR/Cas9技术的后续发展提供思路。
关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑;哺乳动物长期以来，基因疗法一直被寄予希望可以治疗或纠正人和动物体内的各种疾病和缺陷。
随着簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的发现、基于CRISPR的原核生物适应性免疫系统（CRISPR相关系统，Cas）的机制以及它的再利用成为一种有效的基因编辑工具，使得分子生物学领域发生了革命性的变化，并激发了人们对新的和改进的基因治疗的兴趣。
CRISPR/Cas9（规律性成簇间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低的技术之一，已成为当今最主流的基因编辑系统。
一、CRISPR/Cas9系统的起源1987年，日本科学家在研究大肠杆菌的时候发现其基因组上有一段29bp的序列反复出现了数次且彼此之间被一段 32bp的序列所隔开。
1993年，西班牙科学家Francisco Mojica在地中海噬盐菌中也同样发现了这段重复序列。
随着后续的研究，他在二十多种不同的微生物体内都发现了这种重复DNA结构，并将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。
CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用探索CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术，它可以精准地修改DNA序列，并在生物体中实现定点编辑。
近年来，CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中得到了广泛的应用，成为了研究病原微生物的重要工具。
本文将探讨CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用。
一、CRISPR-Cas9技术的基本原理CRISPR-Cas9技术是一种基于细菌天然免疫系统的基因编辑技术，它利用CRISPR序列和Cas9蛋白质组成的复合物来实现DNA序列的精准编辑。
CRISPR序列是一种存在于细菌和古菌中的DNA片段，其中包含了与外源DNA序列相匹配的短片段，可用于识别和清除入侵细胞的病毒或质粒。
Cas9蛋白质是一种RNA导向的DNA内切酶，能够在CRISPR序列识别外源DNA序列后切割其靶标DNA。
CRISPR-Cas9技术的基本操作流程如下：首先，设计合适的RNA引物，使其与目标DNA序列互补配对；然后，引导RNA与Cas9蛋白质结合成复合物，形成RNA-Cas9复合物；最后，RNA-Cas9复合物与目标DNA序列结合，并在目标DNA上切割出一个特定的DNA片段，从而实现基因编辑。
二、CRISPR-Cas9技术在病原微生物研究中的应用1. 病原微生物的基因功能研究CRISPR-Cas9技术可以通过精确编辑病原微生物的基因组，来研究其基因功能和表达调控机制。
例如，在细菌中，CRISPR-Cas9技术可以被用来靶向编辑细菌的基因组，从而揭示其基因功能和代谢途径。
在真菌和病毒中，CRISPR-Cas9技术也可以被用来揭示其基因功能和表达调控机制。
2. 病原微生物的耐药性研究CRISPR-Cas9技术可以被用来研究病原微生物的耐药性机制，并为开发新型抗生素提供新思路。
例如，在细菌中，CRISPR-Cas9技术可以被用来靶向编辑细菌的耐药基因，从而提高抗生素的治疗效果。
基因编辑技术CRISPR-Cas9的应用前景和伦理问题讨论。
1. 引言1.1 概述基因编辑技术是一项革命性的科学技术，它给人类带来了前所未有的机会和挑战。
其中CRISPR-Cas9技术作为最新发展的一种基因编辑工具，引起了广泛的关注。
该技术能够精确地修改生物体的基因序列，为治疗遗传性疾病、改良农作物以及推动药物研发等领域带来了巨大潜力。
1.2 CRISPR-Cas9技术简介CRISPR-Cas9是一种源于细菌免疫系统的天然防御机制，并被科学家们用于基因编辑中。
该技术通过利用Cas9蛋白与RNA引导分子找到特定DNA序列并进行剪切，实现对目标基因进行精确修改的能力。
相比于传统的基因编辑方法，CRISPR-Cas9更加简单、高效、灵活，并在世界范围内迅速被广泛采用。
1.3 目的本文旨在探讨CRISPR-Cas9技术在应用前景中所面临的伦理问题。
随着这项技术渐渐成熟和应用范围的扩大，其中涉及的道德、生物伦理学等问题也日益受到关注。
我们将讨论人类基因编辑的道德考量，以及可能对未来世代和动植物种群生态平衡带来的影响。
同时，本文还将介绍伦理原则在CRISPR-Cas9技术中的应用与挑战，并提出公共政策与监管措施的建议，力求寻求技术进步与伦理平衡之间的良好观点总结。
通过对这些伦理问题进行深入研究和讨论，我们可以更好地推动CRISPR-Cas9等基因编辑技术的发展，并为未来科技发展做出相应规范和决策。
最后，我们将总结当前技术进步与伦理平衡之间关系，并展望未来该领域的发展趋势。
2. CRISPR-Cas9技术的应用前景：2.1 治疗遗传性疾病：CRISPR-Cas9技术在治疗遗传性疾病方面展示出巨大的应用前景。
该技术可以通过定点基因编辑修复患者体内存在的致病突变，从根本上解决遗传疾病的问题。
以囊胚基因编辑为例，科学家们已经成功地利用CRISPR-Cas9技术来纠正一些单基因遗传性疾病，如囊性纤维化和镰刀形细胞贫血等。
4562020年诺贝尔化学奖正式揭晓，法国生物化学家埃马纽埃尔•卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier ）和美国生物学家詹妮弗•杜德纳（Jennifer A. Doudna ）获得这一奖项，表彰她们在“开发基因编辑方法”方面做出的变革型贡献（图1）。
值得关注的是，这是诺贝尔化学奖首次同时授予两名女性科学家。
其实早在2016年，她们就已凭借研发的基因编辑工具“CRISPR/Cas9”，荣获欧莱雅联合国教科文组织联合设立的“世界杰出女科学家成就奖”。
1 获奖者简介及主要贡献卡彭蒂耶，1968年出生于法国，1995年获得法国巴斯德研究所博士学位，现任德国马克斯•普朗克病原体科学研究所主任。
早期博士后阶段她先后在5个国家的9个不同机构进行研究工作，一直致力于研究细菌控制自身基因组的系统。
其主要贡献是发现了一种非常丰富的新型小RNA ：反式作用CRISPR RNA (tracrRNA)，并证明其参与了CRISPR 系统，解析了CRISPR 系统的组分，它包含三个元件：tracrRNA 、CRISPR RNA 和Cas 酶。
此外，卡彭蒂耶还证实了tracrRNA 和CRISPR RNA 相互作用以指导Cas9与病毒序列互作，从而对CRISPR 系统的工作原理进行了阐述[1]。
杜德纳，1964年生于美国华盛顿特区，1989年获美国波士顿哈佛医学院博士学位，现为美国加州大学伯克利分校教授，霍华德•休斯医学研究所研究员。
早年杜德纳与杰克•绍斯塔克（Jack Szostak ）合作进行了RNA 剪接相关研究。
在科罗拉多大学做博士后研究时，她解决了核酶的晶体结构问题。
在自己的实验室，她鉴定了多种RNA 蛋白复合体，例如内部核糖体进入位点和microRNA 的加工过程中的复合体等。
除此之外，杜德纳一直在研究CRISPR 序列及它的工作原理，她使用晶体学和冷冻电镜解决了†通信作者，研究方向：基于造血干细胞的基因编辑和基因治疗。
CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展作者：白英俊李国瑞黄凤兰李威来源：《广西植物》2019年第03期摘要：基因组编辑技术的出现对植物遗传育种及作物性状的改良产生了深远意义。
CRISPR/Cas（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat）是由成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白组成的免疫系统，其作用是原核生物（40%细菌和90%古细菌）用来抵抗外源遗传物质（噬菌体和病毒）的入侵。
该技术实现了对基因组中多个靶基因同时进行编辑，与前两代基因编辑技术：锌指核酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酶（TALENs）相比更加简单、廉价、高效。
目前CRISPR/Cas9基因编辑技术已在拟南芥（Arabidopsisthaliana）、烟草（Nicotianabenthamiana）、水稻（Oryzasativa）、小麦（Triticumaestivum）、玉米（Zeamays）、番茄（tomato）等模式植物和多数大作物中实现了定点基因组编辑，其应用范围不断地向各类植物扩展。
但与模式植物和一些大作物相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术在非模式植物，尤其在一些小作物的应用中存在如载体构建、靶点设计、脱靶检测、同源重组等问题有待进一步完善。
该文对CRISPR/Cas9技术在非模式植物与小作物研究的最新研究进展进行了总结，讨论了该技术目前在非模式植物、小作物应用的局限性，在此基础上提出了相关改进策略，并对CRISPR/Cas9系统在非模式植物中的研究前景进行了展望。
关键词：CRISPR/Cas9系统，植物遗传育种，基因组编辑，非模式植物中图分类号：Q943文献标识码：A文章编号：1000-3142（2019）03-0419-08遗传突变对于研究植物基因功能和作物遗传改良至关重要。
在过去，自然突变体的表征已经揭示了遗传多样性的重要性。
而且，许多研究已经使用了物理方法（γ辐射）、化学方法（甲磺酸乙酯）或生物方法（例如T-DNA/转座子）导致点突变、缺失、重排和基因重组得到突变体。
第38卷第2期2024年3月山东理工大学学报(自然科学版)Journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition)Vol.38No.2Mar.2024收稿日期:20230301基金项目:江苏省高校 青蓝工程 项目(2023);江苏省高职院校青年教师企业实践项目(2021QYSJ063);江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)开放课题(SDGC2239)第一作者:谢钰珍,女,295842442@;通信作者:覃鸿妮,女,qinhn@文章编号:1672-6197(2024)02-0067-06基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株谢钰珍1,覃鸿妮1,2,吴凡1,孙曙光1,孟丽君3(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)摘要:利用CRISPR /Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD -L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP )序列,构建含有PD -L1-GFP 报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株㊂根据CRISPR -Cas9靶点设计原则,针对PD -L1基因终止密码子设计两对sgRNA ,退火形成双链后连接至Lenti -V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证㊂对于正确的Lenti -V2-sgRNA 重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率㊂根据靶点位置设计左同源臂+GFP +右同源臂序列合成Donor 片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证㊂将验证成功的Lenti -V2-sgRNA 和pUC19-donor -GFP 共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP 表达情况,菌落PCR 及基因测序验证GFP 报告基因的靶向插入效果㊂经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD -L1的Cas9载体Lenti -V2-gRNA 和含GFP 基因的Donor 质粒pUC19-donor -GFP 构建成功㊂两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察㊁多克隆验证㊁单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP 成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR 均检测到特异条带,表明在PD -L1终止密码子前成功插入了GFP 片段,细胞株构建成功㊂通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD -L1-GFP 报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD -L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂关键词:PD -L1;CRISPR /Cas9;报告基因;GFP 中图分类号:TB532.1;TB553文献标志码:AConstruction of HT29cell line with PD -L1-GFPreport gene by CRISPR /Cas9systemXIE Yuzhen 1,QIN Hongni 1,2,WU Fan 1,SUN Shuguang 1,MENG Lijun 3(1.School of Biotechnology,Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing,Suzhou 215123,China;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Precision Diagnostics and Therapeutics Development,Soochow University,Suzhou 215000,China;3.Suzhou Dongling Biotechnology Company Limited,Suzhou 215123,China)Abstract :Using CRISPR /Cas9and homologous recombination technology to tap green fluorescent protein (GFP)sequence at specific position of PD -L1gene,we constructed human colon cancer cell (HT29)㊀stable cell line containing PD-L1-GFP reporter gene.According to the design principle of CRISPR-Cas9target,two pairs of sgRNAs were designed for the stop codon of PD-L1gene.After annealing,the sgRNAs were connected to the Lenti-V2plasmid.The plasmid was extracted and verified by sequencing after amplification of the receptor cells.For the correct Lenti-V2-gRNA recombinant plasmid,the effi-ciency of gene editing was verified by T7E1digestion.According to the target location,Donor fragment was synthesized from left homologous arm+GFP+right homologous arm sequence,which was ligated to pUC19after double enzyme digestion.Plasmid extraction and sequencing were also performed after re-combinant vector transformation and amplification.HT29cells were co-transfected with Lenti-V2-gRNA and pUC19-donor-GFP,and the expression of GFP protein was detected by fluorescence microscopy. Finally,the targeted insertion effect of GFP reporter gene was verified by colony PCR and gene sequen-cing.The Cas9vector Lenti-V2-gRNA and Donor plasmid pUC19-donor-GFP containing PD-L1were successfully constructed by enzyme digestion and sequencing.After the two recombinant plasmids were transfected into HT29cells,the results of microscopic observation,polyclonal verification,monoclonal screening and identification showed that GFP was successfully transferred into HT29cells and expressed, and the monoclonal cells screened by limited dilution method had uniform fluorescence.Moreover,com-pared with the control group,specific bands were detected in the genomic PCR of the clones of positive cells,indicating that the GFP fragment was successfully inserted before the PD-L1stop codon,and the cell line was successfully constructed.HT29colon cancer cell line with stable expression of PD-L1-GFP reporter gene was successfully constructed by gene editing technology,and a system was established to di-rectly observe whether PD-L1is expressed and the degree of expression,which laid a foundation for sub-sequent in vitro and in vivo screening of upstream new targets and drugs regulating PD-L1. Keywords:PD-L1;CRISPR/Cas9;reporter gene;GFP㊀㊀PD1(programmed death-1,程序性死亡受体-1)为PDCD1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于活化的免疫细胞表面,如T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及单核细胞等㊂PD1是维持自身耐受性的重要因子,在生理条件下可通过TCR识别抗原,调节外周组织中T细胞的功能,从而应对和清除外源病菌及内源异常细胞㊂PD-L1(程序性死亡配体-1)也称CD274,是PD1的配体之一,是由CD274基因编码的一种细胞表面糖蛋白,多过度表达于肿瘤细胞表面[1]㊂作为重要的负性免疫调节因子,当T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合后,可向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而帮助肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通过特异性靶点抑制PD-L1蛋白的表达,可有效增强肿瘤治疗效果㊂近年来的临床研究结果显示,由PD1/PD-L1通路介导下的免疫抑制在非小细胞肺癌㊁胃癌㊁乳腺癌㊁大肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展中均具有重要作用,PD-L1在以上各种癌组织的表达明显升高,且PD-L1的阳性表达与肿瘤大小㊁转移情况㊁分化程度及远期生存率存在密切关系[2-3];此外,从诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1的相关因素来看,目前已报道的肿瘤细胞中调控PD-L1表达的相关信号通路主要有Akt3信号通路和MAPK信号通路㊁IFN-γ信号通路和AR信号通路[4],而且这些通路的某些抑制剂已被证明可调节PD-L1㊂例如:TGFβR-1抑制剂LY364947可明显降低TGFβR-1诱导的PD-L1mRNA和蛋白表达[5];突变转录因子FOXP3在PD-L1启动子区的结合位点后,胰腺癌细胞PD-L1的表达明显受到抑制[6];但关于结肠癌肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍需进一步研究㊂CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术,通过sgRNA介导核酸酶Cas9对基因组特定位点进行识别㊁切割,从而实现基因编辑,操作相对简便,基因编辑效率高㊂本文利用CRISPR/Cas9技术,在PD-L1基因终止密码子之前插入绿色荧光蛋白GFP基因,通过构建稳定表达PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞株HT29,旨在建立一个可直观观察细胞上PD-L1是否表达以及表达强弱的系统,为进一步研究结肠癌细胞中PD-L1表达的可能调控机制提供帮助,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定基础㊂86山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀1㊀材料与方法1.1㊀材料HT29细胞和293T细胞(苏州东岭生物技术有限公司保存),Lenti CRISPR V2质粒载体和pUC19载体(苏州东岭生物技术有限公司),胶回收试剂盒(Thermo),Stbl3感受态大肠杆菌(TransGen Biotech),DMEM培养基和D10培养基(HYclone), T4连接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀sgRNA引物的设计与合成根据NCBI查询的PD-L1基因序列,使用CRISP在线设计工具(/E-CRISP/),根据靶点设计原则,在PD-L1基因终止密码子处设计sgRNA,并在序列正义链与反义链的5 端添加Esp3I(BsmBI)酶切位点,合成的具体序列如下:sgRNA-1:GAGGAGACGTAATCCAGCAT gRNA-1-F:CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA gRNA-1-R:AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC sgRNA-2:GTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-F:CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-R:AAACGATACACATTTGGAGGAGA为检测突变是否成功,设置了一对检测引物,扩增产物为包含sgRNA靶点的基因组DNA片段,检测引物具体序列如下:Test-F:TGGGGGACAAGCCATCCCAA Test-R:ATGATTTGCTTGGAGGCTCC1.2.2㊀LentiV2-gRNA重组质粒的构建及鉴定根据所设计序列合成单链sgRNA,经梯度降温PCR退火形成双链sgRNA㊂退火结束后,将得到的双链gRNA连接到已用Esp3I酶切回收后的线性Lenti-V2空载质粒中,连接产物转化Stbl3感受态细胞,37ħ培养过夜后挑取阳性单克隆进行测序验证,测序引物:LKO1-5(GACTATCATATGCTTAC-CGT)㊂针对序列正确的单克隆,提取其对应菌液中的质粒DNA,即可得到正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒㊂1.2.3㊀pUC19-Donor-GFP重组质粒的构建及鉴定设计左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列两端添加酶切位点XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,将合成的Donor片段㊁pUC19分别用XhaI和BamHI双酶切后连接㊂取10μL连接产物转化至50μL Stbl3感受态大肠杆菌中,37ħ培养1h 后,均匀涂在含有Amp的LB平板上,过夜培养㊂次日挑取6个克隆于4mL含有Amp的LB培养基中, 37ħ培养16h㊂16h后取1mL菌液抽提质粒,并对质粒进行菌落PCR,判断选取的单克隆中是否含有目的片段㊂将验证正确的质粒送至测序,测序引物:M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC),测序正确后冻存菌种㊂1.2.4㊀细胞培养和细胞转染从-80ħ冰箱中取出冻存的HT29细胞,复苏结束后留2mol/L的细胞量在10cm培养皿中培养,隔天进行传代培养㊂培养至第4天时将HT29转移至24孔板中的2孔(一孔转染,一孔阴性对照),每孔0.5ˑ106细胞㊂转染前1~2h更换新鲜培养基(0.9mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6μg)㊁Donor-GFP(0.4μg)㊁1mg/mL PEI(3μL)㊁DMEM(97μL)配制转染体系,室温孵育30min后,将混合液加入到1孔中,另一个孔无须加入,轻轻摇匀后放入培养箱培养(37ħ,5%CO2)㊂1.2.5㊀多克隆效果验证提取转染后的HT29细胞基因组DNA,利用在PD-L1基因组以及GFP上分别设计的上下游引物,对其进行PCR鉴定,以检测其中是否含有在PD-L1位点成功插入GFP片段的目的细胞㊂引物序列: PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R (CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR体系:模板DNA10ng㊁PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX10μL,总体积20μL㊂PCR扩增程序:98ħ预变性20s,98ħ变性10s,55ħ退火5s,72ħ延伸35s,共30个循环,68ħ彻底延伸2min㊂扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.6㊀单克隆细胞筛选转染72h后,观察细胞生长状况并计数,采用有限稀释法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200μL一个细胞稀释到96孔板中,培养24h 后,显微镜观察荧光及细胞状态,并做好标记㊂继续培养,当上一步标记的单克隆细胞密度达到80%后,消化并收集细胞,用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组,作为检测引物(TestF㊁R)的扩增模板,最后将扩增产物送至公司测序,以检测PD-L1-GFP 报告基因是否插入成功㊂96第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株2㊀结果与分析2.1㊀Lenti -V2-gRNA 重组质粒构建结果重组质粒基因测序结果显示,在酶切位点之间插入的片段位置㊁方向以及序列与预期一致(图1),含有本实验所需要的两条sgRNA 序列,证明LentiV2-gRNA 重组质粒构建成功㊂2.2㊀两条sgRNA 切割效果验证结果为了验证所设计的两条sgRNA 的切割效果,将两种Lenti -V2-gRNA 重组质粒转入293T 细胞后提取基因组DNA,并对其进行T7E1酶切鉴定,结果显示1和2两种sgRNA 都能切下相应大小的条带(图2),证明Lenti -V2-sgR1和Lenti -V2-sgR2都具有切割效果,本实验随机使用其中1条,采用sgRNA2,即Lenti -V2-sgR2㊂图1㊀Lentiv2-gRNA重组质粒测序结果图2㊀T7E1酶切图2.3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒构建结果以挑选的6个单克隆为模板,经菌落PCR 均能扩增出目的片段(图3),说明菌落中含有目标质粒㊂将阳性质粒进一步送至金唯智测序,从图4可以看出,第一行的序列为测序结果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比对完全正确,pUC19-Donor -GFP 质粒构建成功㊂2.4㊀Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 细胞转染结果㊀㊀将Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 转染至HT29细胞,72h 后荧光显微镜下观察细胞状态㊂由图5可知,培养72h后可观察到少量细胞表达绿注:1-6为随机挑取的6个单克隆,M 为DNA marker㊂图3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒转化质粒菌落PCR 结果色荧光,证明GFP 成功转入HT29并进行了表达㊂2.5㊀PD -L1-GFP 报告基因工程细胞株阳性单克隆筛选结果2.5.1㊀多克隆效果验证结果图6为多克隆PCR 鉴定结果,可以发现实验组在200bp 位置有目的条带,而对照组没有,证明GFP 插入到指定位点㊂2.5.2㊀单克隆细胞筛选结果为将上述验证的插入正确GFP 序列位点的细胞挑选出来,将多克隆细胞进行单克隆筛选,图7为荧光显微镜观察结果,可以看到细胞形成了单克隆并且具有均一的荧光,可以进行后续的验证㊂7山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀图4㊀pUC19-Donor重组质粒测序结果(a)细胞图(b)荧光图图5㊀HT29细胞荧光蛋白表达为验证上述挑选的单克隆中所需的序列存在,对其基因组PCR 之后送至金唯智测序,图8显示与正常HT29细胞基因组相比,敲入的实验组所挑的单克隆在终止密码子前插入了GFP 片段,证明细胞系构建成功㊂3㊀讨论PD1表达于活化的免疫细胞表面,如B淋巴细图6㊀多克隆验证琼脂糖凝胶电泳图图7㊀单克隆细胞荧光状态图胞㊁CD4+T 细胞等㊂PD -L1作为PD1的配体之一,在癌组织上可见异常高表达,如肾癌㊁肝癌㊁肺癌㊁乳腺癌及卵巢癌等;但在肿瘤邻近的正常组织中低水平表达,提示它参与肿瘤发生发展,并在削弱抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用㊂PD1/PD -L1是负性共刺激分子,当肿瘤细胞表面的PD -L1与免疫细胞表面的PD1结合时,可抑制免疫细胞的增殖与活性甚至诱导其凋亡,使癌细胞成功逃脱免疫杀伤㊂近年来,PD -L1及其受体PD1信号通路一直是肿瘤免疫领域的热门研究对象,针对阻断PD1/PD -L1通路的单克隆抗体已然成为了肿瘤免疫治疗的明星产品,目前FDA 已经批准了五种PD -L1抑制剂㊂作为非特异性免疫治疗产品,PD -L1抑制剂的抗癌效应具有广谱性,且在不同癌症疾病中显示出了很好的治疗[7-11],但由于治疗过程中的原发性和获得性耐药,相当大比例的患者无法从中受益㊂相较于单药疗法,近年来越来越多的研究正向着PD1/PD -L1耐药机制研究以及联合用药靶点的筛选上转移[12]㊂在一些研究报道中,针对不同类型免疫检查点的联合疗法已被证明对几种肿瘤有效㊂例如:采用抗PD -1抑制剂抗体㊁抗CD137激动剂抗体和疫苗治疗的三联疗法可以显著增强胰腺导管腺癌的治疗效果[13-14];联合anti -PD -L1和anti -TIGIT 在临床上对转移性NSCLC 患者非常有效[15];增强ITCH 活17第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株性可促进PD -L1泛素化降解从而降低肿瘤细胞PD -L1表达,化合物AK087与MAPK 抑制剂联用可明显增强MAPK 靶向治疗黑色素瘤的效果[16]等㊂但对于其他大部分肿瘤来说,不同疗法治疗过程中肿瘤表面PD -L1的表达量变化情况及产生治疗抗性的关键机制,仍需进一步研究㊂注:斜体为GFP 片段,下划线为PDL1终止密码子,WT 为正常HT29测序序列,Knock -in clone 为实验组测序序列㊂图8 对照组和实验组序列对比图㊀㊀为了探究结肠癌细胞表面PD -L1表达的更多可能调控机制,本研究利用CRISPR /Cas9系统和同源重组的原理,通过两次转染将GFP 荧光基团成功插入到PD -L1基因终止密码子之前,成功构建了PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株,通过荧光信号直观观察细胞上PD -L1是否表达以及表达的强弱程度,为进一步研究结肠癌细胞中PD -L1表达的可能调控机制提供了材料,并为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂参考文献:[1]谢丽叶,付杰军,卢奕,等.PD1/PD -L1激活促进癌症发生㊁发展和转移的研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(6):423-427.[2]车章洪.PD -1/PD -L1通路在肿瘤的发生发展过程中对T 细胞的活化作用研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(16):1913-1917.[3]方宇,王海娟,李征洋,等.PD -L1和A2aR 在大肠癌中的表达及意义[J].河北医药,2021,43(3):345-348,352.[4]丰江舟,杨梦梦,朱彬彬,等.人PD -L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J].皖南医学院学报,2016,35(6):524-526.[5]柯佳,李卓伟,李超,等.TGF -β1对结肠癌SW620细胞及其PD -L1表达的影响[C]//中国解剖学会.中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编.昆明:解剖学杂志编辑部,2019:182.[6]王秀超.胰腺癌肿瘤细胞PD -L1表达调控机制及联合干预实验研究[D].天津:天津医科大学,2017.[7]李青丽,唐瑶,李富丽,等.抗PD -L1抗体抑制小鼠非小细胞肺癌移植瘤的生长及其机制[J].肿瘤,2020,40(8):531-540.[8]孙晨,镡云辉,耿波,等.PD -1/PD 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古菌团队“CRISPR系统研究与应用”获新成果10月13日，《Nucleic Acids Research》(IF: 9.112)在线发表了我校农业微生物学国家重点实验室古菌分子生物学研究团队在CRISPR 系统研究与应用中取得的新成果。
论文以“Harnessing Type I and Type III CRISPR-Cas systems for genome editing”为题，首次提出了一种利用I型和III型CRISPR-Cas系统进行基因组编辑的方法。
农业微生物学国家重点实验室佘群新教授和梁运祥教授为论文通讯作者，博士生李英俊为论文第一作者。
CRISPR-Cas系统作为一种原核生物抵御病毒等外源入侵核酸的获得性免疫系统，广泛存在于大约90%的古菌和40%细菌中。
CRISPR-Cas系统被划分为三个主要类型：I型，II型和III型。
II型CRISPR系统仅需要Cas9一个蛋白与一条crRNA和trans-acting RNA行使DNA 干涉活性，简单的II型CRISPR系统因此被开发成基因组编辑工具，并广泛应用于不同的真核生物和细菌。
然而CRISPR/Cas9系统也存在诸多局限性，例如操作程序复杂、脱靶效应以及在极端生物中应用的限制等。
本研究开发的利用I型和III型CRISPR进行基因组编辑的方法，是居于原核生物自身的CRISPR系统，只需要构建一个同时携带人工CRISPR簇和Donor DNA的编辑质粒，该编辑质粒转化到宿主细胞后，人工CRISPR簇提供的crRNA与内源CRISPR系统提供的Cas 蛋白形成核酸蛋白复合体crRNP，对靶标基因进行DNA干涉，然后通过Donor DNA与靶标基因发生同源重组达到对基因组的编辑，编辑类型可以为缺失、插入和突变等。
该方法的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR-Cas 系统的细菌和古菌均可操作；同源重组的参与极大程度上避免了脱靶效应，增强了编辑特异性；更高的编辑效率，筛选阳性率高；流程简单，操作周期短，大大减轻了原核生物基因组编辑的工作量。
