生物工艺学课件PPT之第二章生物工业菌种与种子扩大培养

经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 征、血清学试验等。
现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
（6）毒性试验
自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。
5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；
中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新 抗生素菌种。
华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种 6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）； 农业部兽医药品监察所，北京。
（二）菌种的衰退与复壮
（3） IAM （Institute of Applied Microbiology）， University of Tokyo，Japan。
日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
（4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka， Japan。
发酵研究所，日本大阪。
在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970午7月在国家 科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作 会议，在会上成立了中国微生物菌种保减管理委员会 （CCCMS）委托中国科学院负责担负全国菌种保臧管理业务， 下设六个菌种保藏管理中心。
l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；
中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。
实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。

斜面冰箱保藏法（低温）
➢ 短期、过渡的保藏方法 ➢ 新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生
长丰满后，放在4°C冰箱保存。 ➢ 一般保存期为三个月到六个月。
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第二章 菌种扩 大培养
沙土管保藏法（缺营养、低温）
适合于产孢子或芽孢的微生物。制备方法： ① 将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为1—2：
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产 用种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。
种子液质量的优劣 对发酵生产起着关键性的作用
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第二章 菌种扩 大培养
种子扩大培养 – 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养 而获得一定数量和质量的纯种。这些纯 种培养物称为种子。
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第二章 菌种扩 大培养
菌种保藏的意义
菌种 –微生物学以及生命科学研究的基本材料 –世代时期很短，传代过程中易发生变异、死亡 –造成工业生产菌种的退化、使优良菌种丢失。
菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要 组成部分
要采用最合适的保存方法使菌种的变异和死亡减少 到最低限度
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第二章 菌种扩 大培养
1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左 右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。 一般沙用80目过滤，土用80一100目过筛。 ② 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢 子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干， 放在冰箱内保存。一般保存期为一年左右。
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第二章 菌种扩 大培养
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第二章 菌种扩 大培养
2.2.2 种子罐级数的确定
种子罐级数： 是指制备种子需逐级扩大培养的次数。

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表2-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响
相对湿度 （%）
16.5~19 25~36 40~45
斜面外观
上部稀薄下部稠略黄 上部薄中部均匀发白 一片白，孢子丰富， 稍皱
活孢子计数 （亿/支）
1.2 2.3 5.7
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3、培养时间和冷藏时间 （1）培养时间 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段 ，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。 解决措施： 孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养 。 （2）冷藏时间 斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养 4d左右即于4℃冰箱保存，发现冷藏7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏， 20d未发现自溶。
3、产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成 量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 4、酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。
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五、种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁 感染噬菌体
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河砂40目筛加入1hcl臵30分钟蒸馏水冲洗至中性烘干黄土地表1尺以下瘦晒干磨细1溶入小试管5080装量1cm塞棉塞1211小时或1702小时制菌悬液孢子液每增加01ml悬液真空干燥34小时用p作干燥剂保存与真空干燥状态下4适用于保藏产孢子的放线菌霉菌及产芽孢的细菌孢子芽孢精选ppt6380甘油高压蒸汽灭菌12130min一小时斜面菌种用无菌水制成高浓度101010ml菌悬液液体菌种离心并用无菌生理盐水洗涤各取等体积入菌种管或离心管甘油约4020保存冻存细菌lab酵母应用均较好

● 固体培养基培养孢子 ● 液体培养法
2）生产车间种子制备
⑴ 种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数
级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会， 减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。
种子质量的判断方法
❖通常检测的培养液中参数
➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
●种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 ●耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
2.影响种子质量的因素
接种量
染菌控制
影响种子质量 的因素
种龄
培养基 培养条件
培养基：
主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。
糖份少而氮源多些(菌体增殖为主要目的) 。
与发酵培养基的主要成分相近
*培养温度和湿度：
● 菌体总量适宜 ● 种子生命力旺盛，能缩短延长期，生产性能及生理状态稳定 ● 无杂菌和噬菌体的污染
2.种子制备的过程
●大致可分为：
●实验室种子制备阶段 ●生产车间种子制备阶段
2.种子制备的过程
●种子制备的过程大致可分为： 实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
1）实验室种子的制备
● 一般采用两种方式
温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶 湿度低，孢子生长快； ❖ 湿度大，孢子生长慢
pH：
选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适 当的菌量
❖ 培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的 pH，以便种子能尽快适应新的环境
通风和搅拌：
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用