细胞周期分析注意事项.doc

细胞周期分析偏高注意事项细胞周期分析是用来研究细胞生长和分裂过程的一种实验技术，通过测量细胞在不同细胞周期阶段的比例和持续时间，可以了解细胞周期的调控机制以及细胞增殖的异常情况。

在进行细胞周期分析时，需要注意以下几个方面：1. 细胞处理：在实验开始之前，需要将细胞制备至适宜的生长状态。

通常需要使用细胞培养基培养细胞，不同类型的细胞培养需要根据具体实验要求采取不同的操作方法。

同时，需要注意细胞的数量和密度，以确保细胞可以正常生长和分裂。

2. 细胞收集：细胞周期分析通常使用流式细胞术进行，因此需要先将细胞从培养皿或培养板中收集出来。

收集细胞时，要注意不要使细胞遭受太大的损伤，避免对细胞周期的影响。

可以使用胰酶等酶来进行细胞解聚，也可以使用细胞刮刀轻轻刮取细胞。

收集的细胞应尽可能集中和纯净，以获得准确的结果。

3. 样本处理：在细胞收集完成后，需要对样本进行处理。

通常需要将细胞用PBS 缓冲液洗涤一遍，去除残余的培养基和细胞碎片。

然后，可以使用乙醇等溶剂将细胞固定，以保持其形态结构。

固定时间和温度需要根据不同类型的细胞进行调整。

4. 细胞染色：为了鉴定细胞的不同细胞周期阶段，通常需要对细胞进行染色。

常用的染色剂有荧光素-氨基酸，乙蓝溴化物等。

染色剂浓度和染色时间需要进行优化，以充分显示细胞的染色状态。

5. 流式细胞仪分析：细胞染色完成后，可以通过流式细胞仪对细胞进行分析。

在进行分析之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保测量的准确性。

在设置参数时，需要根据细胞样本的染色状态进行调整，以使流式细胞仪可以准确识别和区分不同细胞周期阶段的细胞。

6. 数据分析：流式细胞仪会生成一系列的图表和数据，需要将这些数据进行统计和分析。

通常，可以使用软件进行细胞周期数据的分析，比如ModFit LT和FlowJo等。

数据分析的目的是了解细胞的增殖速率、细胞周期分布以及细胞周期的调控机制。

在进行细胞周期分析时，还需要注意以下几个技术细节：1. 细胞样本的保存：实验完成后，需要妥善保存细胞样本，以备后续的实验分析。

M o d f i t分析细胞周期指南本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.MarchModfit分析细胞周期指南本指南只提供在guava流式细胞分析仪上使用细胞周期模块分析后产生的数据，其它请参阅产品使用说明书，本指南仅供参考。

一．概述细胞周期的概念：细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束，都要经历相同的变化阶段(即G1→S→G2→M )周而复始地进行活动，细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。

一个细胞周期包括有丝分裂期(M)和分裂间期(G1、S、G2)。

尽管在各种细胞中各期所占时间都不尽相同，但相对而言M期最短，S期却较长。

分裂间期：1 、G1期，前一次有丝分裂完成到S期开始。

各种与DNA复制有关的酶明显增多，线粒体、叶绿体、核糖体增多，内质网在更新扩大，高尔基体、溶酶体都增加，中心粒彼此分离、复制。

2、S期：DNA、组蛋白合成3、G2期， S期结束后到有丝分裂开始。

由上可以看出G2期、S期、M期反映了细胞的增殖活性，特别是G2期、S期（因M期较短）。

因而，G2/M％+S％反映了细胞增殖能力。

二者有无差别要进行统计检验。

细胞周期阻滞：对于生殖细胞及保持增殖能力的细胞(如干细胞)，由于细胞不断的增殖，细胞总是处于从G1 、S、G2 和M 期的连续的细胞周期中。

在细胞周期的各阶段，细胞分别进行着DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。

每一阶段都是下一阶段的准备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前监测与一个细胞周期顺利完成相关的生化事件，这包括各种体内外因素威胁下游事件进行时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理阶段的能力，而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。

只有前一阶段的生理活动完成后，才能通过称为检定点的阶段，进入周期的下一步，一些突发事件引发的细胞反应能影响驱动细胞周期前进的因子，从而使细胞周期停滞在检定点，这被称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。

高中生物细胞周期课程教案课时：2课时教学目标：1. 了解细胞周期的定义和基本特征；2. 掌握细胞周期不同阶段的特点和变化；3. 了解细胞周期与细胞分裂的关系；4. 能够描述细胞周期的四个阶段及其重要事件。

教学内容：1. 细胞周期的定义和基本特征；2. 细胞周期的四个阶段：有丝分裂期(间期)、有丝分裂期(前期)、有丝分裂期(中期)、有丝分裂期(后期)；3. 各个阶段的特点和重要事件。

教学准备：1. 教学PPT和教学视频；2. 细胞周期的示意图和图解材料；3. 实验器材：显微镜、显微镜玻片和盖玻片、生理盐水、可视化芯片等。

教学过程：第一课时：1. 导入：通过展示细胞周期的示意图引起学生对细胞周期的兴趣；2. 讲解细胞周期的定义和基本特征；3. 分组讨论：让学生分组讨论细胞周期的四个阶段的特点和变化；4. 汇报讨论结果。

第二课时：1. 讲解细胞周期的四个阶段及其重要事件；2. 示范观察：通过显微镜观察细胞在不同阶段的变化；3. 实验操作：让学生使用显微镜观察实验材料，理解细胞周期的不同阶段；4. 总结：总结细胞周期的关键内容，帮助学生巩固知识。

教学评价：1. 教师对学生的回答和讨论进行评价，鼓励学生积极参与；2. 通过实验操作，检验学生对细胞周期的理解和掌握程度；3. 帮助学生总结细胞周期的重点知识，进行口头或书面总结。

教学反思：通过本节课的教学，帮助学生了解细胞周期的概念和特点，掌握细胞周期不同阶段的变化和重要事件，培养学生科学思维和实验能力。

可以通过更多的实验操作和案例分析来丰富教学内容，激发学生的学习兴趣，提高学生对细胞周期的理解和掌握程度。

课堂互动探究案1 细胞周期和细胞的有丝分裂考点一细胞的生长和增殖的周期性任务驱动·探究突破任务1 细胞增殖的周期性(1)细胞增殖①细胞增殖包括________和________整个连续的过程。

②方式③意义：是生物体__________________的基础。

(2)细胞周期①概念：连续分裂的细胞,从一次分裂完成时开始,到下一次分裂______时为止,为一个细胞周期。

②适用范围：a.进行______分裂的细胞才有细胞周期；b.______分裂的细胞才有细胞周期。

(3)判断下列哪些细胞具有细胞周期A．根尖分生区细胞B．植物形成层细胞C．神经细胞 D．人表皮细胞E．哺乳动物成熟红细胞 F．干细胞G．生发层细胞 H．洋葱表皮细胞I．浆细胞①具有细胞周期的是：________。

②判断的理由：这些细胞都是________的细胞。

任务2 细胞周期的表示方法总结：判断一个完整的细胞周期的方法(1)细胞周期以________为起点,而不能以分裂期为起点。

(2)分裂间期的时间________分裂期。

[技法提炼](1)判断一个完整的细胞周期的方法①“先长后短”：一个细胞周期一定要先经过一个长的间期,再经过一个短的分裂期。

②“终点到终点”：从完成时开始,到完成时结束,为一个细胞周期。

③“先复制后分裂”：一个细胞周期一定要先完成DNA的复制,才能完成细胞的分裂。

(2)解答有关细胞周期的三个技巧①只有连续分裂的细胞才具有细胞周期,高度分化的体细胞(如神经、肌肉细胞)和减数分裂产生的生殖细胞不具有细胞周期。

②细胞周期的长短由遗传物质决定,同时受环境因素影响。

③在观察有丝分裂时,应选择分裂期相对较长的材料,有利于观察到处于不同分裂时期的图像。

(3)细胞周期中的三种变化分析策略①基因突变：在细胞分裂间期,DNA复制时容易受到内外因素的干扰而发生差错,即发生基因突变。

②染色体变异：在细胞分裂前期,秋水仙素或低温都可抑制纺锤体的形成,出现多倍体细胞。

细胞周期测定实验细胞计数法：实验方法原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。

它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

实验材料细胞试剂、试剂盒胰酶甲醇培养液冰醋酸Giemsa染液仪器、耗材CO2培养箱普通显微镜培养皿盖玻片吸管实验步骤一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

三、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

五、计算分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%展开注意事项1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。

其他一、Giemsa染液配制称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。

56℃中保温90-120分钟。

加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。

使用时按要求用PBS稀释。

一般稀释10倍。

BrdU参入法实验方法原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。

从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。

细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。

如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。

细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。

计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

实验材料细胞试剂、试剂盒BrdU 甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC 柠檬酸三钠NaCl仪器、耗材冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜实验步骤一、试剂配制1. BrdU配制BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。

流式细胞检测细胞周期一、所需试剂1、细胞周期检测试剂盒（1）PI：Propidium Iodide，碘化丙啶，是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，如果自己买，那就10mg用200mlPBS 溶解，4℃避光保存（0.05mg/ml）（2）RNAase：PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解，如果自己买，那就100mg用20mlPBS溶解，200μl分装-20℃避光保存（5mg/ml）2、预冷70%-75%酒精：可用无水乙醇和纯水配制3、预冷PBS4、流式管：可以去医研中心拿二、实验步骤<一>、细胞处理1、种板处理等同功能实验（保证细胞有2-5×10*5个）2、消化细胞，离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。

3、用预冷的PBS清洗细胞1-2次。

4、离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀5、固定细胞：用0.2ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入2ml预冷70-75%酒精，震荡，4℃固定过夜。

（直接向细胞加入酒精容易使细胞成团，震荡不要过猛，容易使细胞破碎）<二>、细胞染色和检测1、离心（1000r/300g 5min）收集固定的细胞2、2mL的预冷PBS洗细胞一次，离心再次获取细胞沉淀3、染色：加入50μlRNA酶和250μl-450μl PI染色剂（用量根据试剂盒说明书），避光染色5-10min（一般加300μl，保证适当细胞浓度，浓度太高检测速度太快，结果不准；浓度太低检测速度太慢，时间太长）4、上机检测三、注意事项1、流式细胞仪原理看ppt非荧光信号（1）前向角散射光（FSC Forward scatter）细胞相对大小及其表面积（2）侧向角散射光（SSC side scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性2、PI(碘化丙啶)不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

PI标记法检测细胞周期1.实验原理：PI染料即碘化丙啶，是流式检测细胞周期应荣最为广泛的荧光染料。

PI能与细胞内的双链DNA和RNA结合，被488nm激光激发后发射红荧光，与核酸结合后其发射荧光信号的能力会提高20~30倍。

PI染料不能自由穿过活细胞完整的细胞膜，标记时需先用乙醇固定细胞，使细胞膜的通透性增加，这样PI染料就能通过细胞膜进入细胞内与核酸结合，标记时需同时加入RNA酶消化细胞内的RNA，使PI只能与细胞内的DNA 结合，反映细胞内DNA的含量，继而通过细胞内DNA的含量确定细胞周期。

后来发展了用低渗的柠檬酸溶液一步标记PI燃料法，细胞在低渗的条件下其细胞膜的通透性增加，PI染料就可以进入细胞膜如细胞内的DNA结合，此法简便，快捷，应用更为广泛。

2.试验步骤PI标记方法一（乙醇固定法）：（1）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取2x106细胞，离心沉淀，弃上清。

（2）200μl PBS重悬沉淀于1.5mlEppendorf管中，缓慢加入1ml预冷的（保存于4℃）的70%乙醇固定目标细胞。

充分混匀，4℃静置30min。

（3）离心沉淀，弃上清，200μl适当浓度的PI染液重悬细胞，同时加入RNA酶，充分混匀，4℃静置30min。

（4）离心沉淀，弃上清，200μl流式PBS重悬沉淀，流式上样分析。

PI标记方法二（低渗法）（1）低渗柠檬酸标记液配制：柠檬酸三钠0.25g，TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)0.75ml,PI 0.025g，RNA酶0.005g，用双蒸水补足至250ml。

（2）将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液，取2x106细胞，离心沉淀，弃上清（3）1ml低渗柠檬酸标记液重悬沉淀，充分混匀，4℃静置30min.（4）离心沉淀，弃上清，200μl流式PBS重悬沉淀，流式上样分析。

3.注意事项检测细胞内DNA含量时必须保证样品内的细胞都是处于单细胞状态，但是在实际样品中经常会出现粘连的双细胞和多细胞团块，而流式细胞仪可能会将粘连在一起的两个二倍体细胞当作是一个四倍体的细胞，如果粘连的细胞较多而没有在分析时排除流式分析时就会得到比实际情况高很多的G2/M期细胞的比例，得到的流式结果就不准确。

细胞实验K-8实验步骤(4天)☐接种1000-5000个细胞到96孔板中，加入200ul的培养基，在培养箱中培养（过夜）（三天，每天分别接种1000、2000细胞各三孔，共六孔）☐换新鲜的培养基，加入20ul的cck-8溶液（避光处理，加200ul培养基加20ul，加100ul只需加入10ul）☐分别在0.5h、1h、2h、4h时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（即OD值）☐酶标仪操作：KC Junior软件（606室）—new protocol—protocol name--Readmethod--Primary:450;performce:630--template--sample--拖区域--其他不需要改变--read plate --ID：日期+0.5h。

☐制作图表注意事项：1.接种细胞时，细胞的数目不能相差太大；2.加入cck-8溶液时，要注意避光，且不能有气泡，否则会影响结果；3.酶标仪测OD值时，最好设计一个对照波长。

2. Transwell实验☐收集细胞并计数☐接种2X105细胞/200ul于transwell小室，小室外加入500ul的完全培养基☐上室中加入4ug/ml mitomycin共培养，培养12h、24h后，分别取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，移到另外一个有500ul4%PFA固定15-20分钟，再用棉签擦去微孔膜上层细胞，倒立，放另外一个板放入4°冰箱。

☐姬姆萨染色：⏹加入0.5ml的姬姆萨A液，染色1min⏹再加入1ml的姬姆萨B液，轻轻摇匀，染色10min⏹水洗，干燥☐镜检：在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野☐注意：1.上述实验均在24孔板中进行；2.transwell小室中种细胞时，注意细胞悬液不要弄到小室外，否则，会影响结果，造成人为误差；3.固定前，一定要把微孔膜上层的细胞擦干净；4.加入姬姆萨B液后，一定要摇匀，否则会造成染色不均匀；水洗时，要注意水流不要太快太大，否则会把细胞冲掉3.Wound healing实验（2到3天）☐大皿细胞大>70%可铺6孔板，没株细胞铺两孔（前一天或前晚），细胞长到95%以上时，待用☐加入4µg/mL 的mitomycin C，5%CO2 37℃培养2h☐每孔划3或5条痕，PBS洗两次（尽量洗去柱内细胞），加入加入4µg/mL 的mitomycin C，拍照，即为0h的数据（最小枪头，快，不拖）☐在6h、12h、24h、48h、72h分别拍照☐注意事项：1.细胞的密度要足够大；2.划痕时要在有培养基或PBS的情况下进行；3.划痕后，要清洗干净，痕中最好不要有细胞残留；4.要及时换新鲜的培养基。

植物细胞周期观察一、实验目的1．学会植物细胞、组织的固定、离析和压片方法，了解并初步掌握制作临时玻片和永久玻片的方法。

2．观察有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化过程，着重了解分裂期内中、后期染色体变化的特征。

二、实验原理植物根尖分生组织的细胞，依一定的程序有规律地进行着有丝分裂过程，植物种类不同，细胞周期所需时间不同。

每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再放置在显微镜下进行观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。

一些植物根尖细胞的分裂周期（小时）根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位，根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。

如果植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。

实验结果显示：植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同时不同植物有丝分裂高峰时间不尽相同，洋葱根尖细胞以6点到9点分裂相较多。

适于取材。

三、实验材料大蒜、洋葱的鳞茎或蚕豆的种子四、实验器具和药品1．用具：载玻片，盖玻片，指管，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，吸水纸。

2．药品：无水酒精，冰醋酸，醋酸钠，改良苯酚品红。

五、实验过程1．材料培养先剪去洋葱的老根，然后置于盛有水的烧杯上，等不定根长出2cm时，进行预处理；或将蚕豆等种子经过吸胀处理24小时后，平展于铺有吸水纸的白磁盘中，加入适当量的水，于25℃培养，待侧根长到2cm进行预处理。

2．预处理预处理可以降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，使更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前把根尖放到药剂中处理3—4小时。

可利用进行处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8—羟基喹啉等，也可以经过低温处理以达到同样的效果，较成功的例子主要是一些禾本科的农作物，例如：小麦、黑麦、大麦用1~4℃，水稻和玉米用6~8℃，均获得较好的效果。

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。

主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。

2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。

3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。

4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。

5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。

注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。

如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。

2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。

3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。

4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。

其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。

在此不赘述。

yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。

应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。

PI染色检测细胞周期实验步骤PI（Propidium Iodide）染色是一种常用的细胞周期分析方法，可用来定量分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。

下面是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤：实验步骤：1.细胞培养：将要进行细胞周期实验的细胞株在无菌条件下培养至富有活力的生长期，并确保细胞数目足够。

2.细胞收获：将培养皿中的细胞用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤2次，以去除残留的培养基和衰老细胞。

然后用细胞解离液将细胞从培养皿上彻底剥离。

3.细胞计数：采用显微镜或血球计算板等工具计数细胞数目。

确保每个实验条件下的细胞数相似。

4. 固定细胞：用70%（体积比）的乙醇在-20℃的环境中将细胞固定。

将乙醇均匀地加入细胞悬浮液中，一般细胞浓度为1×10^6/ml。

放置细胞悬液在-20℃的冰箱中固定1小时。

5.染色：将固定的细胞在室温下洗涤2次PBS。

制备PI染色液，可以选择适当的PI浓度（如50μg/mL）然后将染色液加入洗涤后的细胞悬液中，使之均匀包涵。

在黑暗中静置15分钟以便细胞充分染色。

6.流式细胞仪检测：使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。

在流式细胞仪前，将细胞过滤，以去除聚团的细胞。

7.数据分析：使用流式细胞仪的软件或其他分析软件对所得数据进行细胞周期分析。

基于DNA含量，细胞可以被分为G0/G1、S和G2/M三个周期阶段，通过计算这些细胞的百分比可以得到细胞周期分布情况。

注意事项：1.实验要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。

2.在染色时，应在黑暗的环境中操作，以避免PI受光照的影响。

3.使用流式细胞仪时，要注意正确设置仪器参数，以获取准确的测量结果。

4.实验前后仔细清洁工作区和实验设备，以防止交叉污染。

以上就是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤，根据实验的需求和细胞类型的不同，还可以对实验步骤进行适当的调整。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。

在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。

以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。

根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。

2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。

碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。

RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。

磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。

流式细胞仪专用的上样管。

3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。

离心机：用于离心细胞。

二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。

2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。

3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。

4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。

5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。

三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。

2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。

乙醇的最终浓度应在 70%左右。

3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。

四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。

2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。

3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。

4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。

Caspase-3活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,PARP]等的裂解。

方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次，5~10min/次？→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果：[图9-1、图9-2]2、荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。

根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC.在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。

根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，制备细胞裂解液，加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物），37°C反应1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。

细胞实验K-8实验步骤(4天)☐接种1000-5000个细胞到96孔板中，加入200ul的培养基，在培养箱中培养（过夜）（三天，每天分别接种1000、2000细胞各三孔，共六孔）☐换新鲜的培养基，加入20ul的cck-8溶液（避光处理，加200ul培养基加20ul，加100ul只需加入10ul）☐分别在0.5h、1h、2h、4h时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度（即OD值）☐酶标仪操作：KC Junior软件（606室）—new protocol—protocol name--Readmethod--Primary:450;performce:630--template--sample--拖区域--其他不需要改变--read plate --ID：日期+0.5h。

☐制作图表注意事项：1.接种细胞时，细胞的数目不能相差太大；2.加入cck-8溶液时，要注意避光，且不能有气泡，否则会影响结果；3.酶标仪测OD值时，最好设计一个对照波长。

2. Transwell实验☐收集细胞并计数☐接种2X105细胞/200ul于transwell小室，小室外加入500ul的完全培养基☐上室中加入4ug/ml mitomycin共培养，培养12h、24h后，分别取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层细胞，移到另外一个有500ul4%PFA固定15-20分钟，再用棉签擦去微孔膜上层细胞，倒立，放另外一个板放入4°冰箱。

☐姬姆萨染色：⏹加入0.5ml的姬姆萨A液，染色1min⏹再加入1ml的姬姆萨B液，轻轻摇匀，染色10min⏹水洗，干燥☐镜检：在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野☐注意：1.上述实验均在24孔板中进行；2.transwell小室中种细胞时，注意细胞悬液不要弄到小室外，否则，会影响结果，造成人为误差；3.固定前，一定要把微孔膜上层的细胞擦干净；4.加入姬姆萨B液后，一定要摇匀，否则会造成染色不均匀；水洗时，要注意水流不要太快太大，否则会把细胞冲掉3.Wound healing实验（2到3天）☐大皿细胞大>70%可铺6孔板，没株细胞铺两孔（前一天或前晚），细胞长到95%以上时，待用☐加入4µg/mL 的mitomycin C，5%CO2 37℃培养2h☐每孔划3或5条痕，PBS洗两次（尽量洗去柱内细胞），加入加入4µg/mL 的mitomycin C，拍照，即为0h的数据（最小枪头，快，不拖）☐在6h、12h、24h、48h、72h分别拍照☐注意事项：1.细胞的密度要足够大；2.划痕时要在有培养基或PBS的情况下进行；3.划痕后，要清洗干净，痕中最好不要有细胞残留；4.要及时换新鲜的培养基。

流式检测细胞周期与凋亡样品处理流程1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液2.1000r/min离心5min，收集沉淀。

3.沉淀用PBS洗2次，1000r/min离心5min，收集沉淀。

4.细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜。

即可送检。

备注：1。

每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集)，细胞量少可能测不出结果,或结果不太准确。

2。

样品可在-20℃保存一个月流式检测细胞DNA倍体样品处理流程1。

胰蛋白酶消化法收集细胞,做成单细胞悬液2。

1000r/min离心5min，收集沉淀。

3。

沉淀用PBS洗2次,加入相应种属的淋巴细胞或鸡红细胞做为内参，内参与预检测细胞的比例为1：34。

1000r/min离心5min，收集沉淀.5。

细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜.即可送检.备注：1。

每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集）,细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在—20℃保存一个月检测胞内蛋白上机前细胞处理流程1.收集实验处理好的细胞，用PBS洗2次，2%多聚甲醛固定15min.2.离心弃掉多聚甲醛，再用70％的冰乙醇固定过夜（4℃）。

3.离心弃掉乙醇，PBS洗一遍，加破膜剂0。

5%TritonX—100 50ul/106个细胞15min。

4.直接在0.5%TritonX—100中加一抗室温孵育30min，离心，用PBS洗一次，加荧光标记二抗（需进口二抗，国内的效价比较低效果不好)，总体系为100ul，总体系中应含0.25%（体积分数）的TritonX-100，室温孵育30min。

5.也可以直接加FITC直标的一抗。

6.离心,用PBS洗一次,用2％的多聚甲醛固定，4℃存放待测.备注：1。

市面上的多聚甲醛多为4％的,可用PBS稀释。

如果用两步标记,应做不加一抗，只加二抗的对照管2。

未染色的新鲜标本贮存方法如下:10%二甲基亚砜，90％小牛血清，5×106～1×107细胞在—70℃过夜，然后置液氮中可长期保存。