实验三 酶促转氨反应

转氨基反应及GPT活性测定一、实验目的：1、掌握转氨基反应的过程。

2、掌握层析分离的原理和方法。

3、了解茚三酮能使游离氨基酸显色。

二、实验原理：1.转氨基反应转氨基反应是氨基酸代谢和嘌呤合成过程中的重要反应。

指的是一种α-氨基酸的α-氨基在转氨酶的催化下，转移到α-酮酸的酮基上，生成相应的α-氨基酸；而原来的α-氨基酸则转变为相应的α-酮酸。

谷丙转氨酶（GPT）催化的转氨基反应：2.层析层析分离技术是一种物理的分离混合物的方法。

在互相接触的两相中，混合物各组分的物理化学性质的不同（如分子大小、结构、极性、吸附力等），导致各组分在两相中的分配系数各不一样。

当混合物随着流动相流动时，由于各组分在两相中分配系数不一样，导致不同的组分在固定相中“静止”的时间不一样，这样就表现为随流动相运动速度不一样。

谷氨酸的相对分子质量为167,丙氨酸的相对分子质量为89，谷氨酸带有负电荷，极性更强。

根据相似相容原理，谷氨酸的分配系数相对小于丙氨酸的分配系数。

所以谷氨酸迁移慢。

本实验使用纸层析。

某种组分在固定相中的移动速度可用Rf值来表示：3.氨基酸的茚三酮反应茚三酮可与脯氨酸反应显黄色，与其它所有天然氨基酸反应显紫色。

常用此反应检测氨基酸的存在。

三、实验步骤：1.肝匀浆制备取新鲜大白鼠肝脏1 g，在瓷研钵中用剪刀剪碎，逐步加入9 mL冰冷的0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液，迅速研磨成匀浆。

2.GPT催化的转氨基反应取干燥洁净的小试管2只，按下表操作：混匀后置37℃水浴半小时。

然后立即将测定管放入沸水浴中10min以终止反应。

取出冷却后，两管同时离心，将上清液分别转移至干燥小试管中。

3.层析①取直径为12 cm的圆形滤纸一张，用圆规作半径为1cm的圆，过圆心作2条垂直的直线。

在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯大小）②用毛细滴管在1、3处点测定和对照管上清液各2-3滴。

注意斑点小于0.5cm，每点一滴，要用电吹风吹干后才能点后一滴。

实验二（2）转氨酶（GPT）活性的测定一．研究背景及目的转氨酶是生物体内重要的一类酶。

转氨酶催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸，这种作用被称为转氨基作用[1]。

转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。

其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。

GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用，可作为一些疾病诊断的指标。

GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转变为丙酮酸与二氧化碳。

由于都有丙酮酸的生成，所以可以通过实验测定一定时间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。

本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。

二．原理由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高，易于测得，且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料，对其中的一种重要转氨酶——GTP的活性进行测定。

转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法，本实验采用的是金氏法。

该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃，pH7.4条件下，与底物作用60min后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。

丙酮酸含量的测定运用的是比色法。

丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。

三．材料、试剂与仪器材料：新鲜家兔肝脏和血清试剂[1]：①磷酸盐缓冲液（pH7.4）甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液乙液：1/15 mol/L磷酸氢二钾溶液取甲液825ml，乙液175ml，混合，测得pH为7.4即可。

生物化学实验转氨酶的提取氨基移换反应与纸上层析生物化学实验--转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析实验三转氨酶的提取、氨基移换反应与纸上层析一、实验目的1、1.学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。

2.学习用纸层析法测定转氨基作用。

3、介绍氨基移换促进作用在中间新陈代谢中的意义。

二、实验原理、氨基移换酶也称转氨酶，它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，形成新的α-氨基酸与新的α-酮酸的作用.这种作用称为氨基移换作用。

它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上都起着很重要的作用。

任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。

它们的最适ph接近7.4。

在各种转氨酶中，以谷氨酸草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、got)及谷氨酸丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、gpt)活力最强。

上述两种酶均广为存有于生物机体中，在正常人血清中也存有少量存有。

机体出现肝炎、心肌梗塞炎症时，血清联运氮酶活力明显减少，在临床上转氨酶活性的测量存有关键意义。

测量转氨酶活性的方法很多，例如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。

在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。

此过程可用下式表示:植物中多种氨基酸是通过转氨基作用合成的。

纸层析：就是以滤纸做为支持物的分配层析法，就是20世纪40年代发展出来的一种生化拆分技术。

由于设备直观，操作方式便利，所须要样品量太少，分辨力较低等优点而广为的用作物质的拆分，并可以展开定性和定量的分析。

缺点就是进行时间较长。

分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。

在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率rf值）就不同，从而达到分离的目的。

《生物化学实验》课程大纲一、课程概述课程名称（中文）：生物化学实验（英文）：Biochemistry Experiment课程编号：课程学分：1.0课程总学时：30课程性质：科类基础课前修课程：无机化学实验，有机化学实验二、课程内容简介（300字以内）生物化学是农学、畜牧学、生物学等各专业相关课程的重要基础课程，是一门实验性很强的学科，其生物化学实验课在生物化学教学中占据重要地位。

生物化学实验紧密围绕生物化学实验技术的教学需求，主要针对蛋白质、酶、核酸、脂类、糖、维生素等生物分子的分离、提取、分析、鉴定和定量测定技术等内容进行课程实验项目的设计和教学，加强学生对生物化学实验技术的学习，巩固和掌握生物化学实验技术的基本理论、基本知识、实验技能，提高学生创新思维意识、综合分析问题和科学实验的能力，鼓励学生将所学知识运用于实际工作中去。

三、教学目标与要求生物化学实验是农业院校重要的专业基础课程，是培养学生创新精神、实践能力的重要平台，是塑造高层次农业科技专门人才的基本环节之一。

通过该课程的学习后，学生能够掌握生物化学实验的基本原理和操作方法，能够独立进行实验并具有发现问题和解决问题的能力，能够根据实验记录，结合理论知识，合理地分析结果，并学习对实验中出现的问题进行讨论，提出解决方案或改进措施。

总的目标是提高学生综合分析能力，培养学生熟悉科学研究的基本程序和基本思维。

四、学时分配注：生物化学实验课程总计1学分，安排8次实验（不含选修），其中验证性实验占62.5%，综合性、设计性实验占37.5%。

五、教学内容与安排实验一：酶促转氨反应的分析鉴定(3学时)（一）实验目的：通过本实验掌握纸层析的一般原理和方法；掌握利用纸层析研究代谢的基本方法，了解酶促转氨反应在中间代谢中的意义。

（二）实验主要仪器：层析缸；培养皿；电吹风机；烘箱；恒温水浴锅；培养皿；毛细管；研钵；针、线。

（三）实验内容与方法：1. 提取材料的酶液；2. 用纸层析法鉴定酶促转氨反应中转氨基产物丙氨酸的存在与否；3. 通过计算其R f并与标准氨基酸对照，判断反应产物样品的氨基酸组成。

竭诚为您提供优质文档/双击可除转氨作用实验报告篇一：实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告实验六纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09救援一班第三大组李岚宇20XX222336室温：28°（一）实验目的：1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。

（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。

转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。

氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。

各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。

纸层析属于分配层析。

以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。

有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。

由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：ALT物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。

（三）实验材料与仪器：试剂：1、0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液。

2、0.2mol/Lna2hpo4溶液81ml与0.2mol/Lnah2po4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。

3(:转氨作用实验报告)、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/Lph7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0nnaoh仔细调至ph7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。

氨基转移作用实验报告氨基转移作用实验报告概述：氨基转移作用是生物化学中一种重要的酶促反应，它在细胞内起着关键的代谢调节作用。

本实验旨在通过观察氨基转移作用的实验现象，了解其机理和应用。

实验材料与方法：1. 实验材料：- 氨基转移酶：选取乳酸脱氢酶（LDH）作为氨基转移酶。

- 底物：选择乳酸和α-酮戊二酸作为底物。

- 辅助试剂：包括缓冲液、辅酶NADH等。

2. 实验方法：- 步骤一：制备实验体系。

1) 首先制备含有LDH的反应液。

2) 分别制备含有乳酸和α-酮戊二酸的底物溶液。

3) 准备辅助试剂。

- 步骤二：进行氨基转移作用实验。

1) 将LDH反应液、乳酸溶液和α-酮戊二酸溶液混合，加入辅助试剂。

2) 记录反应体系的吸光度变化。

- 步骤三：数据处理与分析。

1) 绘制吸光度-时间曲线。

2) 分析曲线的趋势和特点。

实验结果与讨论：在实验中，我们观察到了氨基转移作用的实验现象。

根据实验结果，我们得出以下结论：1. 氨基转移作用是一个动态过程。

在实验过程中，我们观察到反应体系的吸光度随时间的变化而发生明显的变化。

这表明氨基转移作用是一个动态的过程，随着时间的推移，底物被转化为产物。

2. 氨基转移作用具有特异性。

在本实验中，我们选择了乳酸和α-酮戊二酸作为底物。

根据实验结果，我们发现只有在有LDH存在的情况下，反应体系才会发生明显的吸光度变化。

这说明氨基转移作用具有特异性，只有特定的底物和酶才能发生反应。

3. 氨基转移作用在生物代谢中起重要作用。

氨基转移作用是细胞内一种常见的代谢调节过程。

通过将氨基基团从一个底物转移到另一个底物，细胞可以调节代谢途径中的物质转化和平衡。

本实验结果进一步验证了氨基转移作用在生物代谢中的重要性。

结论：通过本实验，我们深入了解了氨基转移作用的实验现象、机理和应用。

氨基转移作用是生物化学中一个重要的酶促反应，对于生物体的代谢调节起着关键作用。

进一步的研究和应用可以帮助我们更好地理解细胞内的代谢过程，并为药物研发和疾病治疗提供理论基础。

谷氨酸摇瓶发酵生物工程xxx xxx xxxxxxxxx摘要根据谷氨酸的发酵机理，本实验通过摇瓶补料发酵生产谷氨酸，并对发酵过程中产谷氨酸量、发酵液OD值、残糖量进行连续的测定。

试验结果表明：四瓶发酵培养基中，只有添加有玉米浆的发酵培养基产谷氨酸，另外3瓶以酵母膏代替玉米浆成分的发酵液都不产谷氨酸。

关键词：谷氨酸发酵摇瓶培养前言1.1 谷氨酸发酵机制在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有三种：（1）谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应；（2）转氨酶（AT）催化的转氨反应；（3）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应。

谷氨酸的合成主要途径是α—酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。

α—酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。

由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径如下图1所示，至少有16步酶促反应。

图1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。

因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。

1.2 谷氨酸生产菌种的选择目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。

我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌、天津短杆菌等。

为革兰氏阳性菌，菌体为球形、短杆状和棒状，不同形状芽孢，没有鞭毛，不能运动，需要生物素作为生长因子，在通气条件下才能生产谷氨酸。

本实验选择天津短杆菌来摇瓶发酵生产谷氨酸。

1.3谷氨酸发酵过程控制谷氨酸发酵过程中，产生菌种的特性、生物素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。

在实际生产中只有针对存在的问题，严格控制工艺条件，才能达到稳产、高产的目的。

发酵初期，菌体生长迟滞，约2～4h后即进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH 值至7.5～8.0，同时保持温度为30～32℃。

实验29氨基转移反应的定性鉴定实验报告学生姓名唐思亮学号专业化学与环境学院年级、班级2007级理科综合二班课程名称生物化学实验实验项目氨基转移反应的定性鉴定实验类型□验证□设计□综合实验时间2008年11月24 日实验指导老师陈文利老师实验评分一、实验目的1、学习一种鉴定氨基转移作用的简便方法及其原理；2、进一步掌握纸层析的原理和操作技术；3、了解氨基转移作用在中间代谢中的意义。

二、实验原理氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。

它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。

任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。

它们的最适pH 接近7.4。

在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力最强。

它们催化的反应如下：上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。

机体发生肝炎、心肌梗塞病变时，血清中转氮酶活力显著增加，在临床上转氨酶活性的测定有重要意义。

测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。

本实验利用纸层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。

为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。

三、实验材料、试剂和器具（一）实验动物：家兔（饥饿16h）（二）试剂(1) 1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性）(2) 1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性）(3) 1/15mol/L pH7.4磷酸缓冲液（pH=7.4）(4) 0.1%碳酸氢钾溶液(5) 0.05%碘乙酸溶液(6) 30%乙酸(7) 标准丙氨酸溶液(0.5%)(8) 标准谷氨酸溶液(0.5%)(9) 0.1%水合茚三酮乙醇溶液(10) 酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40ml，再加入新蒸馏的无色的苯酚150g。