下载文档原格式
文章编号:1006-3110(2012)11-1615-03#论著#肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定胡燕,白冰珂,沈宏辉,侯俊,高蓉,罗声栋,貌盼勇摘要:目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株V P1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。
方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,I PT G诱导后经SDS-PAG E和Western blot验证蛋白表达的特异性。
结果重组质粒在1mmol/L的IPT G37e诱导6h后可诱导表达得到约33KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。
VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。
结论获得特异性的EV71病毒河南分离株V P1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。
关键词:肠道病毒71型;V P1蛋白;原核表达中图分类号:R373.2文献标识码:A DOI:10.3969/j.iss n.1006-3110.2012.11.005Expression and Identification of VP1Protein of Enterovirus71Isolates from Henan H U Y an,Bai Bing-ke,S hen H ong-hui,et al.(302M ilitary H osp ital of China,Beij ing100039,China)Abstract:Objective T o expr ess VP1pr otein of enterovir us71iso lates from Henan Province in E.coli,and to prov ide basis for antibody preparation and virus detection kit development.Methods V P1gene was amplified by one-step RT-PCR and cloned into pET28a to construct the recombinant prokaryotic ex pression plasmid,pET-VP1.Specific VP1protein was ex pressed by IPT G-induction and test ed by SDS-PAGE and Western blot.Results A protein of about33K D w as obtained six hours after IPT G-induction at37e.I t mainly ex isted as an insoluble inclusion body.T he specificity of the expressed protein was indicated by W estern blo t with anti-V P1monoclonal antibody and anti-His mo noclonal antibody.C onclusions T he specific V P1pro tein of enterovirus71isolates from Henan is obtained.It can be applied in the development of virus diagnosis kit.Key words:Enter ovirus71;V P1protein;Prokaryotic expression手足口病是婴幼儿的一种常见传染病。
肠道病毒71型分子生物学研究【摘要】就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。
【关键词】肠道病毒71型基因型分子流行病学Molecular Biological Research on 7I Intestinal VirusLin Xin, Han GuangenZhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053)Abstract: It makes review on EV 71 intestinal virus about its biological characteristic, replication, diagnosis technology, EV type identification and molecular epidemic science.Key words: intestinal virus; EV 71; gene type; molecular epidemic science近年，肠道病毒71型(EV71)感染在世界各地不断出现爆发流行的报道。
EV7I感染主要引起手足口病，但所致的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。
本文从有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。
1 病毒的一般特征1.1 病毒颗粒结构及理化性质肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员［1］。
EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。
病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VPI、VPZ、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。
我国分离的肠道病毒71型(SHZH 03病毒株)全基因组核苷酸序列分析周世力1,2,李琳琳23,何雅青2,杨洪2,喻子牛1,金奇2(1.华中农业大学生命科学技术学院,武汉 430070;2.中国疾病预防控制中心 病毒基因工程国家重点实验室,北京 100052)摘要:对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03进行了全基因组(未包括多聚腺苷尾)7406个碱基的核苷酸序列测定。
结果表明,SHZH03株与其它肠道病毒71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5′U TR 和3′U TR 区的长度和序列有一定的差异。
核苷酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与SHZH98株、中国台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高(分别为92.5%,90.1%和87.9%),与新加坡流行株SIN5666、SIN5865及标准株MS 、BrCr 的同源性则在81%左右,而与Coxsackievirus A16(Cox.A16)的同源性最低(63.6%)。
氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Cox.A16的同源性最低,但在P2和P3区SHZH03株与Cox.A16的同源性最高。
P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和中国台湾1998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,属于同一型(genogroup ),而与标准株BrCr 和MS 的亲缘关系较远。
上述结果有助于肠道病毒71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防。
关键词:肠道病毒71型;核苷酸序列分析;同源性分析中图分类号:R373.2 文献标识码:A 文章编号:1000-8721(2004)01-0007-05收稿日期:2003-11-19;修回日期:2003-12-03作者简介:周世力(1966-),男,江汉大学副教授,博士,从事病毒基因工程方面的研究。
3同等贡献通讯作者:金奇,中国疾病预防控制中心病毒基因工程国家重点实验室研究员,北京100052,E 2mail :zdsys @ 肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)是小RNA 病毒科(Picornaviridae )肠道病毒属(En 2terovi rus )成员,其感染主要引起患者手足口病(hand 2foot 2and 2mouth disease ,HFMD )。
肠道病毒71型（EV71）的检测作者：张宪华来源：《中国现代医生》2015年第20期[摘要] 目的探讨肠道病毒71型（EV71）的检测方法。
方法采用酶联免疫法（ELISA 法）、免疫胶体金法（胶体金法）、荧光定量PCR法（PCR法）对1399例手足口病患儿的样本进行检测，并对检测结果进行卡方检验。
结果 1399例手足口病患儿样本ELISA法、金标法、PCR法结果的阳性率分别为37.8%、36.0%、39.8%，三种方法检验结果无显著性差异（χ2=4.197，P>0.05）。
ELISA法与胶体金法及PCR法结果比较均无显著性差异（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；胶体金法与PCR法两者之间差异有统计学意义（χ2=4.26，P[关键词] 肠道病毒；EV71；胶体金法； ELISA；PCR[中图分类号] R446.6；R450 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）20-0093-03Detection of enterovirus 71 （EV71）ZHANG XianhuaLaboratory Department， the Fifth People's Hospital of Anyang City in He'nan Province，Anyang 455000， China[Abstract] Objective To investigate the enterovirus 71 （EV71） detection methods. Methods Samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， immune colloidal gold method （colloidal gold method） and fluorescence quantitative PCR method （PCR method）， and the chi-square test was conducted on these detention results. Results The positive rates of samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease by the ELISA method， the gold standard method and the PCR method were 37.8%，36.0% and 39.8%， respectively， without significant difference（χ2=4.197， P>0.05）. The colloidal gold method and the PCR method had no significant differences （χ2=0.959， P>0.05；χ2=1.180， P> 0.05）. The colloidal gold method and the PCR method， had significant difference between the two methods （χ2=4.26， P[Key words] Enterovirus； EV71； Colloidal gold method； ELISA； PCR肠道病毒71型（EV71）是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒。
肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析摘要】目的分析肠道病毒71型2011年本地流行株VP1基因特征学特征。
方法收集2011年本地手足口病患者临床标本332份，进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定，采用RT-PCR对15株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增，并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析。
根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71 VP1序列进行同源性和亲缘进化分析。
结果 165份标本鉴定为EV71，分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.5%～99.9%和99.4%～100%。
与C4a亚型的核苷酸和氨基酸最高。
亲缘进化树显示，本地株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支。
结论本地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近，有共同进化的趋势，属于C4基因亚型的C4a进化分支，并存在多个传播链。
【关键词】肠道病毒71型基因特征遗传进化手足口病（hand，foot and mouth disease， HFMD）是由多种肠道病毒引起的，严重威胁儿童健康的全球性传染病。
临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹，伴有发热、咽痛、倦怠乏力等症状，个别重症患儿病情进展快，可发生死亡。
为全面了解本地区手足口病病原学分布的情况，对本市446份手足口病临床诊断标本进行检测，现将结果报告如下。
1 材料和方法1.1 标本来源2009～2010年各医院送检的HFMD临床诊断标本共332份，其中粪便、咽拭子、肛拭子、脑脊液、气管洗液标本各201、72、43、12、4份。
1.2 核酸提取和荧光定量RT-PCR检测采用QIAGEN Reansy Mini Kit试剂盒，操作步骤参照Rneasy Mini kit Handbook。
上海之江生物科技有限公司生产的肠道病毒71型荧光检测试剂盒和柯萨奇病毒A 组16型荧光检测试剂盒。
1.3 EV71 VP1基因扩增将检测为EV71阳性的病毒核酸进行全长VP1编码区的核苷酸序列测定和分析。
中国生物制品学杂志2013年9月第26卷第9期Chin J Biologicals September 2013，Vol.26No.9手足口病（hand -foot -mouth disease ，HFMD ）是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。
可引起HFMD 的肠道病毒有20多种（型），其中以柯萨奇病毒A16型（Coxsackie A16virus ，CoxA16）和肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）最为常见，而发病死亡的患儿主要是因为感染了EV71［1-3］。
目前，尚无公认的可用于人的有效疫苗可供使用［4］。
因此，该疫苗的研制十分紧迫。
本实验对EV71疫苗制备过程中病毒收获液的蛋白成分进行初步分析，以期为该类疫苗的研发及质控提供参考。
肠道病毒７１型收获液蛋白成分的分析高嵩，李爱灵，黄浩，赵玉秀，苏桂民，王辉北京天坛生物制品股份有限公司，北京100024摘要：目的分析肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）收获液中的蛋白成分，为该类疫苗的研发及质控提供参考。
方法将EV71安徽阜阳株接种于Vero 细胞，病毒培养72h 后，收获病毒液，经蔗糖密度梯度超滤离心、甲醛灭活、DEAE Sephorase FF 介质离子交换层析纯化，获得纯化样品。
应用透射电镜分析样品中病毒颗粒的形态；对非还原型SDS -PAGE 检测疑似病毒衣壳抗原蛋白VP1和VP3条带进行N -末端氨基酸序列分析；液相色谱（liquid chromatogra －phy ，LC ）与电喷雾电离质谱（electrospray ionization ，ESI -MS ）结合的方法分析样品中所含的蛋白成分。
结果纯化的EV71样品在透射电镜下可观察到20～30nm 的球形EV71颗粒，呈典型的肠道病毒形态；经SDS -PAGE 分析，第2和第3条带所在位置与文献报道的EV71衣壳蛋白VP1和VP3大小相符，N -末端氨基酸序列与GenBank 报道的安徽阜阳株序列（ACD63039.1）一致；LC ／ESI -MS 质谱分析显示，纯化EV71样品中病毒蛋白成分占绝对优势，包括EV71的蛋白多聚体、VP1、VP2、VP3、VP4蛋白。
结论对EV71疫苗制备过程中病毒收获液的蛋白成分进行了初步分析，为该类疫苗的研发及质控提供了参考。
关键词：肠道病毒71型；纯化；蛋白成分中图分类号：R373.2+3R392-33文献标识码：A 文章编号：1004-5503（2013）09-1201-05Analysis of protein component of harvested liquid of enterovirus 71GAO Song,LI Ai -ling,HUANG Hao,ZHAO Yu -xiu,SU Gui -min,WANG HuiBeijing Tiantan Biological Products Co.Ltd,Beijing 100024,China Corresponding author:WANG Hui,E -mail:wh6247@Abstract ：Objective To analyze the protein component in harvested liquid of enterovirus 71（EV71）and provide a ref －erence for development and quality control of EV71vaccine.MethodsEV71Anhui Fuyang strain was inoculated toVero cells and cultured for 72h,and the harvested liquid was concentrated by sucrose density gradient centrifugation combined with ultrafiltration,inactivated with formaldehyde and purified by DEAE Sepharose FF ion exchange chromatog －raphy.The morphology of virus particles in test samples was analyzed by transmission electron microscopy,while the amino acids at N -terminus of suspected virus capsid protein VP1and VP3bands determined by non -reduced SDS -PAGE were sequenced ，and the protein component by liquid chromatography （LC ）and electrospray ionization （ESI -MS ）.Re －sults Spheroidal particles at sizes of 20~30nm were observed in purified EV71samples under transmission electron microscope,which showed typical morphology of enterovirus.SDS -PAGE showed that the locations of the 2nd and 3rd bands were consistent with those of VP1and VP3of EV71reported respectively.The amino acid sequences at N -terminus of the two bands were consistent with that of EV71Anhui Fuyang strain reported in GenBank （ACD63039.1）.LC ／ESI -MS showed that viral protein components were prominent in purified EV71,including polymer,VP1,VP2,VP3and VP4.Conclusion The protein component of virus liquid during preparation of EV71vaccine were preliminarily analyzed,which provided a reference for development and quality control of the vaccine.Key words ：Enterovirus 71（EV71）；Purification ；Protein component·疫苗研究·通讯作者：王辉，E -mail ：wh6247@1201··DOI:10.13200/ki.cjb.0001401材料与方法1.1毒株及细胞EV71安徽阜阳株（AHYF087-P5V3工作毒种）由北京生物制品研究所有限责任公司李秀玲研究室提供；Vero细胞（129代，第2007-0117批工作代）由天坛生物制品股份有限公司疫苗四室提供。
1.2主要试剂199培养基由北京天坛生物制品股份有限公司培养基室提供；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司；DMEM培养基购自美国SAFC公司；测序级胰蛋白酶购自瑞士Roche公司；丙酮购自北京北化精细化学品有限公司；DTT购自北京化学试剂公司；SDS、HCl、APS、TEMED、丙烯酰胺、三叉丙烯酰胺、Trish和溴酚蓝购自北京化工厂；DEAE Sephorase FF介质购自美国GE公司。
1.3细胞培养及病毒接种复苏冻存的129代Vero细胞，用含10%小牛血清的199培养基培养细胞，按1∶6的比例传代扩增。
待细胞传至133代时，按MOI0.014接种EV71，于33℃培养病毒。
病毒接种20h后，用0.013mol／L的PBS（pH7.4）洗涤3次，加入含0.1%人血白蛋白的DMEM维持液（pH7.4）维持培养。
病毒培养至72h后，收获病毒。
1.4病毒的浓缩、灭活及纯化收获的病毒液经28000r／min蔗糖密度梯度超滤离心16h，1∶4000甲醛25℃灭活7d后，经DEAE Sephorase FF介质进行离子交换层析纯化。
1.5纯化ＥＶ７１样品的鉴定1.5.1电镜分析将纯化EV71样品送中国农业科学院原子能研究所进行透射电镜扫描分析。
1.5.2SDS-PAGE及VP1和VP3N-末端氨基酸测序分析纯化的EV71样品经12%非还原型SDS-PAGE分析后，对与文献报道相符的疑似病毒衣壳抗原蛋白VP1和VP3条带进行N-末端氨基酸序列分析［5］。
1.5.3LC／ESI-MS质谱分析纯化EV71样品送北京蛋白质组研究中心，采用液相色谱（liquid chro-matography，LC）与电喷雾电离质谱（electrospray io-nization，ESI-MS）结合的方法，应用ESI-FTICR液质联用仪对样品中所含蛋白组分进行初步鉴定，设置条件为：检索NCBI-2009数据库、胰蛋白酶酶解方式、最大允许肽质量误差±0.5Da；每个肽只允许有1个不完全裂解位点；可能的修饰方式Carbami-domethyl（C）和Oxidation（M）。
2结果2.1纯化ＥＶ７１样品的电镜分析结果纯化的EV71样品在透射电镜下可观察到20～30nm的球形EV71颗粒，呈典型的肠道病毒形态，见图1。
A：200nm；B：500nm。
图1纯化EV71样品的透射电镜扫描图（×80000）Fig1.Transmission electron microscopy of purified EV71（×80000）2.2纯化ＥＶ７１样品的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及ＶＰ１和ＶＰ３Ｎ-末端氨基酸测序结果纯化EV71样品经12% SDS-PAGE分析，第2和第3条带所在位置与文献报道的EV71衣壳蛋白VP1和VP3大小相符，见图2。
测序结果显示，条带2的N-末端氨基酸序列为Gly Asp Arg Val Ala，条带3的N-末端氨基酸序列为Gly Phe Pro Ala Glu，与GenBank报道的安徽阜阳株序列（ACD63039.1）一致，条带1为VP2和VP4的组合（前体蛋白VP0）。
