野生苋属植物籽实中新型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化和结构与功能研究
- 格式：pdf
- 大小：2.35 MB
- 文档页数：99
湖南师范大学硕士学位论文野生苋属植物籽实中新型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化和结构与功能研究姓名：王琳申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王贤纯;梁宋平20050501摘要从野生苋属植物（Ａｒｅａ．ｒａｎｔｈｕｓｐａｎｉｃｕｌａｔｕ西籽实中发现了两种新型Ⅱ一淀粉酶的蛋白质类抑制剂（分别命名为ｗＡＩ－１和ＷＡＩ一２），并对其性质、结构及结构与功能的关系进行了系统的研究。
通过反相高效液相色谱（１ｉｐ—ＨＰＬＣ）分离纯化技术得到纯化的ＷＡＩ—ｌ和ＷＡＩ一２。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测得其分子量分别为９８６．５Ｄａ和１０２７．５Ｄａ，是目前报道的分子量最小的Ｑ一淀粉酶的蛋白质类抑制剂。
ＷＡＩ—ｌ能在弱酸性条件下，以非竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道Ⅱ一淀粉酶的活性。
最适抑制ｐＨ值为６．０。
３７＂Ｃ下与酶预温浴约３０ｍｉｎ后显示最大抑制活性。
当ａ一淀粉酶用量一定时，ａ一淀粉酶活性的抑制率在约５０％的范围内随抑制剂／酶比例的增大而呈线性增加，超过５０％后，抑制率随抑制剂／酶比例的增大而缓慢上升，最终达到最大值（约６５％）。
ＷＡＩ－１具有较强的热稳定性。
经８０４Ｃ水浴１２０ｍｉｎ后，抑制率为５８．７％；ｌ００６ｃ水浴１０ｒａｉｎ后，抑制率仍有２３．０８％。
ＷＡｌ—１对入唾液淀粉酶、猪胰腺Ⅱ一淀粉酶、枯草杆菌Ｑ一淀粉酶和米曲霉Ⅱ一淀粉酶活性均无影响。
ＷＡＩ一１对美洲蜚蠊消化道。
一淀粉酶的抑制活性大于黄粉虫消化道Ｑ一淀粉酶的抑制活性。
通过氨基酸组成分析和Ｅｄｍａｎ降解测序以及串联质谱技术解析ＷＡＩ－１的结构。
初步的分析结果表明，ＩＶＡＩ一１是由９个氨基酸残基组成的环状多肽，Ｎ端为焦谷氨酸。
稀ＨＣｌ水解导致的焦谷氨酸侧链开环不明显影响它的抑制活性，但胰蛋白酶处理导致整个环状分子开环时会使抑制活性完全丧失。
ＷＡＩ一２能在弱酸性条件下，以竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道Ｑ一淀粉酶的活性。
最适抑制ｐＨ值为５．５。
３７。
Ｃ下与酶预温浴约３５ｒａｉｎ后显示最大抑制活性。
当Ⅱ一淀粉酶用量一定时，ａ一淀粉酶活性的抑制率在约６０％的范围内随抑制剂／酶比例的增大而呈线性增加，超过６０％后，抑制率随抑制剂／酶比例的增大而缓慢上升，最终达到最大值（约７０％）。
ＷＡＩ一２也具有较强的热稳定性。
经８０。
Ｃ水浴１２０ｉｎｉｎ后，抑制率约为５０％：经１００。
Ｃ水浴１０ｍｉｎ后，抑制率仍有约３０％。
ＷＡＩ－２对入唾液淀粉酶活性无影响。
对美洲蜚蠊消化道Ⅱ一淀粉酶的抑制活性大于对黄粉虫消化道ａ一淀粉酶、猪胰腺Ⅱ一淀粉酶和米曲霉Ⅱ一淀粉酶的抑制活性。
ＷＡＩ一２的抑制活性低于ＷＡＩ一１和ＡＡＩ。
关键词：蛋白质类抑制剂，抑制活性，结构，功能，苋属植物，ａ一淀粉酶ＡＢＳＴＲＡＣＴＴｗｏＢｏｒｅｌｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｎａｍｅｄＷＡＩ一１ａｎｄＷＡ卜２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌＹ，ｈａｖｅｂｅｅｎｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｗｉｌｄａｍａｒａｎｔｈ（Ａｍａ？＇ａｎｔｈｕｓ＂ｐａｎｉｃｕＭｔｕｓ）ｗｅｅｄｓ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ，ＷＡＩ—ｌａｎｄＷＡＩ一２ｗｅｒｅｐｕｒｌｆｉｅｄｂｙＲＰ－ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ—ｐｈａｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ１ｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），ａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＷＡＩ—ＩａｎｄＷＡＩ一２ｈａｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｏｆ９８６．５Ｄａａｎｄ１０２７．５ＤａｒｅｓｐｅｃｔｉｒｅｌＹ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒ—ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ—ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）．ＴｈｅｙａｒｅｔｈｅｓｍａｌｌｅｓｔｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＱ—ａｍｙｌａｓｅｆｏｕｎｄＳＯｆａｒＷＡＩ—ｌｃｏｕｌｄｐｏｔｅｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｄ—ａｍｙｌａｓｅｏｆＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａ破ｅｒｉｃａｎａｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔｉｎａｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｒｉｖｅｍａｎｎｅｒｕｎｄｅｒｍｉＩｄａｃｉｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｔｐｉｔ６．０ＷＡＩ一１ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｔ３７。
Ｃｆｏｒａｂｏｕｔ３０ｍｉｎ．ＷｈｅｎａｆｉｘｅｄａｍｏｕｎｔｏｆＵ—ａｍｙｌａｓｅｕｓｅｄ，ａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ／ｅｎｚｙｍｅｒａｔｉｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅＱ—ａｍｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅ１ｉｎｅａｒｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｕｐｔｏａｂｏｕｔ５０％，ａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｌｏｗｌＹｕｐｔｏａｍａｘｉｍｕｍｏｆａｂｏｕｔ６５％．Ａｆｔｅｒｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ８０℃ｆｏｒ１２０ｍｉｎＷＡｌ－１ｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔ５８．７％ｏｆｄ—ａｍｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ：ａｆｔｅｒｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ１００℃ｆｏｒ１０ｍｉｎ，ＷＡ［一ｌｃｏｕｌｄｓｔｉ１ｌｌｅａｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ２３．０８％．ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＷＡＩ—ｌｈａｓｓｔｒｏｎｇｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉ１ｉｔｙ．ＷＡＩ—ｉｄｉｄｎｏｔｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｈｕｍａｎｓａｌｉｖａｒｙＱ—ａｍｙｌａｓｅ．ｈｏｇｐａｎｃｒｅａｔｉＣⅡ一ａｍｙｌａｓｅ．ｂａｃｉｌ１ｕｓｓｕｂｉ１ｉｓＱ—ａｍｙｌａｓｅａｎｄａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅｎ—ａｍｙｌａｓｅ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＷＡＩ—ｌｔｏＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔＱ—ａｍｙｌａｓｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｔｏｙｅｌ１０ｗｍｅａｌｗｏｒｍｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔⅡ一ａｍｙｌａｓｅ．ＡｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉＳ，ＥｄｍａｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＷＡＩ一１，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＷＡＩ一１ｗａｓａｃｙｃｌｉｃｎｏｎａｐｅｐｔｉｄｅｗｉｔｈＮｔｅｒｍｉｎａｌｐｙｒｏｇｉｕｔａｍａｔｅ．ＤｉｌｕｔｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃａｃｉｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉＳｏｆＷＡＩ一１ｍａｄｅｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｏｐｅｎｓｉｄｅ—ｃｈａｉｎｌｏｏｐ，ｗｈｉｃｈｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｒｙｐｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆＷＡＩ一１ｍａｄｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌｅｃｌｅａｖｅｄａｔｃ—ｔｅｒｍｉｎａｌｏｆａｒｇｉｎｉｎｅ．ｗｈｉｃｈｍａｄｅＷＭ一１ｌｏｓｅｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙ．ＷＡＩ一２ｐｏｔｅｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｎ—ａｍｙｌａｓｅｏｆｔｈｅＰｅｒｉｐ］ａｎｅｔａａ脚ｅｒｉｃａｎａｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔｉｎａｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｍａｎｎｅｒｕｎｄｅｒｍｉ１ｄａｃｉｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｔｐＨ５．５．ＷＡＩ一２ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｔ３７℃ｆｏｒａｂｏｕｔ３５ｍｉｎ．ＷｈｅｎＡＢＳＴＲＡＣＴａｆｉｘｅｄａｍｏｕｎｔｏｆａ—ａｍｙｌａｓｅｕｓｅｄ，ａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ／ｅｎｚｙｍｅｒａｔｉｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅⅡ一ａｍｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ１ｉｎｅａｒｌｙｕｐｔｏａｂｏｕｔ６０％．ａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｌｏｗｌｙｕｐｔｏａｍａｘｉｍｕｍｏｆａｂｏｕｔ７０％．ＡｆｔｅｒＷＡＩ一２ｗａｓｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄａｔ８０℃ｆｏｒ１２０ｍｉｎ．ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉＯＨｒａｔｅｃａｕｓｅｄｂｙＷＡＩ一２ｏｆＱ—ａｍｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓａｂｏｕｔ５０％，ａｆｔｅｒｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ１００℃ｆｏｒ１０ｍｉｎ．ＷＡＩ一２ｃｏｕｌｄｓｔｉ１１ｌｅａｄｔｏｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｏｆａｂｏｕｔ３０％，ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＷＡＩ一２ａｌｓｏｈａｓｓｔｒｏｎｇｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＷＡＩ一２ｄｉｄｎｏｔｉｎｈｉｂｉｔｈｕｍａｎｓａｌｉｖａｒｙⅡ一ａｍｙｌａｓｅ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＷＡＩ一２ｔｏＰｅｒｉｐ］ａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔ醢一ａｍｙｌａｓｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｔｏｙｅｌ１０ｗｍｅａｌｗｏｒｍｄｉｇｅｓｔｉｖｅｄｕｃｔⅡ一ａｍｙｌａｓｅ，ｈｏｇｐａｎｃｒｅａｔｉｃａ—ａｍｙｌａｓｅａｎｄａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＵ—ａｍｙｌａｓｅ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＷＡＩ一２ｉＳｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆＷＡＩ—ｌａｎｄＡＡＩ．ＫｅｙＷｏｒｄ：ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅＯＵＳｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｍａｒａｎｔｈ，Ⅱ一ａｍｙｌａｓｅ第一章ｎ－淀粉酶抑制剂的研究进展投本研究的目的意义第一章ｎ一淀粉酶抑制剂的研究进展及本研究的目的意义１ａ一淀粉酶蛋白质类抑制剂研究的背景和意义Ｑ一淀粉酶（ＥＣ．３．２．１．１）是～类用途十分广泛的存在于自然界的水解酶。
粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业都经常使用“３。
它作用淀粉时可从分子内部切开Ｑ—ｌ、４糖苷键，生成糊精和还原糖从而催化淀粉水解睁３１。
产物的末端残基第一个碳原子构型为ａ构型，故称Ｑ一淀粉酶。
能与。
一淀粉酶分子上的相应部位结合后并引起Ｑ一淀粉酶分子构象改变，使它的催化活性降低或丧失的化合物称为Ｑ一淀粉酶抑制剂。
它们属于糖水解酶抑制剂的一种，对人和哺乳动物、昆虫以及微生物的ｄ一淀粉酶有很强的特异性抑制作用Ｈ１。
因此，研究淀粉酶蛋白质类抑制剂，既有重要的理论意义，又有广阔的应用前景：农业上，为设计新型无毒无污染杀虫、杀菌药物，减少环境污染提供实验材料，为转基因抗病虫农作物新品种的培育提供理论依据。
