体外分析技术

Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。

有效地排除非特异性物质对结合反应的干 扰。
二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合（non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体，在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合（主要应用：放射免疫分析）
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎： • 早期：T3,T4升高，然后降低，
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤：TG升高。 • 全身性疾病：心血管疾病、肿瘤等： • T3下降，rT3、TSH升高。
（二）肾上腺疾病
• 皮质醇增多症： • ACTH\COR正常情况下有节律分泌，检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症：尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度：测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度（sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
（三）质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统

（3）分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。
双抗体法(测量B)： 用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体，用第一抗 体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。
当RIA反应完成后，于反应液中加入第二抗体，第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物，其分子量比第一抗体复合物大，可用离心方法分离 出来，称为双抗体法（double antibody method）。
(一)实验室内质量控制： 是一个实验室内部实验方法的质量控制，以便在一个人 的同一批或不同批实验中，不同操作者和不同方法之间有 可比性。 零标准管结合率（B0%）：即最大结合率，指不加非标记抗 原时，标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30%～50%，该 指标主要用来反映标记物与抗体的质量是否稳定。 非特异性结合率（NSB%）：指不加抗体时标记抗原与非特 异物质的结合率，一般要求＜5%～10%。 最低浓度管与最高浓度管的结合率之差：＞30%。
标准曲线直线回归的参数：包括截距a、斜率b和相关系数r， 要求a、b值稳定，r ＞ 0.99。 ED25、ED50与 ED75：指标准曲线的结合率在25%、50%和75%时 对应的抗原浓度值，它反映标准曲线的稳定性，有助于批间 结果的比较。 质控图：连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控 血清的均数±标准差（x±s），画出均数线与两个标准差的 范围，将以后每次实验测定的高、中、低值标在图上，即为 质控图。 WHO要求在一次实验中有下列情况之一者，其结果应舍弃： ① 三种QCS中有一个测定值＞3s； ② 三种QCS中在同一方向上有两种＞2s；
2．反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争 性的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIA快。
3．灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的 10～100倍。

实验核医学
Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人：
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析（RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay（RIA)
一、基本原理：
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外，以放射性核素标记抗原和非标记抗原，同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤：
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线，查找待测物 浓度
b值稳定，r＞0.99。
4．ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25％、50％及75％时对应的抗原浓度值，
它反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。
5．反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标，RER应＜0.04。
6．质控图
WHO要求在一次实验中，有下列情 况之一者，其结果应予舍弃：
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
（一）、质量控制
1．最高结合率(B0％) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率，一般要求在30～50％。
2．非特异性结合率(NSB％) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率，一般要求＜5～10％。