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6、2005-植物转基因-PMI的应用

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第41卷第3期2005年5月林业科学SCIE NTI A SI LVAE SI NIC AE V ol 141,N o 13May ,2005PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用3杨　莉　徐昌杰　陈昆松(浙江大学园艺系农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室　杭州310029)摘　要:　介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(P MI )法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。

P MI 能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。

该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。

目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。

其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。

安全评估结果表明P MI 基因对人体健康和环境无害。

P MI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。

关键词:　磷酸甘露糖异构酶(P MI )基因;甘露糖;植物;转基因中图分类号:S718146;Q94312 文献标识码:A 文章编号:1001-7488(2005)03-0137-05收稿日期:2003-12-09。

基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(G 2000046806),国家自然科学基金(30100125)和浙江省自然科学基金(301291,Z D0004)资助。

3陈昆松为通讯作者。

Application of PMI /Mannose Selective System in Plant G enetic T ransformationY ang Li Xu Changjie Chen K unsong (Department o f Horticulture ,Zhejiang Univer sity The State Agriculture Ministry Laboratory o fHorticultural Plant G rowth ,Development &Biotechnology Hangzhou 310029)Abstract :　A novel selective system ideal for plant trans formation was introduced.The system uses E scherichia coli phosphomannose isomerase (PMI )gene as the selectable marker gene and mannose as the selective agent.PMI is an enzyme catalyzing the conversion of mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate ;the latter can be further metabolized in glycolysis.T rans formed cells can grow normally utilizing mannose as carbon source ,while non-trans formed cells cannot because of non-metabolizable nature of mannose-6-phosphate.The trans formation frequency was affected by genotypes ,sugars other than mannose ,concentrations of phosphate and culture conditions.The system has been evaluated in w oody plants ,sweet orange and grape ,as well as in annual crops and is regarded to be an ideal replacement for traditional antibiotic or herbicide selective systems.Besides general methods for detecting transgenic plants ,plants trans formed with PMI gene can be assayed by enzyme activity analyses.Especially ,the chlorophenol red (CPR )method for PMI activity analysis is sim ple ,reliable ,and need no expensive reagents.The plants trans formed with PMI gene were dem onstrated to be safe to human health and environment.All the results indicate that PMI is an effective selective marker for plant trans formation.K ey w ords :　phosphomannose isomerase (PMI )gene ;mannose ;plant ;genetic trans formation1983年首例转基因作物的问世为人们提供了一种新的育种方法,可将有益基因转入植物而不会改变原有品种的优良性状。

抗生素或除草剂筛选是植物转基因的常规步骤。

但是,抗生素或除草剂等药物对植株转化有较大影响,会影响转化细胞的生长及再生,并抑制不定根再生(刘凡等,1993);其次,标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。

人们担心在转基因作物的商品化种植过程中,其中的除草剂抗性基因可能经自然杂交,而抗生素基因可能通过转染肠道细菌,从而造成自然界的非转基因作物对除草剂、人类对抗生素产生抗性(Dale ,1999;K uiper et al .,2001)。

虽然也有不少手段可以去除转基因植物中的标记基因(Scuu et al .,2002),但大多效率不高,或者需要进行子代杂交,这对木本植物来说不是十分现实。

针对抗性筛选对转化及再生的不利影响,人们试图不采用抗性筛选而直接根据报告基因的表达获取再生植株,但也存在转化效率低、转基因沉默等问题(Dominguez et al .,2002),因而应用不是十分广泛。

近年来,人们开始采用一种新型的正筛选方法———甘露糖筛选体系。

该体系以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose is omerase ,PMI )基因为标记基因,甘露糖为筛选剂进行筛选。

目前,PMI/甘露糖筛选体系已成功用于甜菜(Beta vulgaris )(Joersbo et al .,1998;2000)、拟南芥(Arabidopsis thaliana )(T odd et al .,2001)、玉米(Zea mays )(Negrotto et al .,2000;Wang et al .,2000;Wright et al .,2001)、小麦(Triticum aestivum )(Wright et al .,2001)、水稻(Oryza sativa )(Lucca et al .,2001)、木薯(Manihot esculenta )(Zhang et al .,2000a ;2000b )等植物;在木本植物甜橙(Citrus sinensis )(Boscariol et al .,2003)和葡萄(Vitis vinifera )(Reustle et al .,2003)等上也有报道。

本文主要就PMI 基因的作用及原理、影响因素、在木本植物转基因中的应用、检测方法和安全评估等方面对PMI/甘露糖筛选体系进行介绍。

1　PMI 基因的作用及原理自然界中的植物大都没有PMI 基因[肉桂(Cinnamomum cassia )和一些豆类除外](Lee et al .,1984),但它在植物以外的生物界却广泛存在,人们已从细菌、酵母、动物及人体中都分离到该基因,并获得纯化蛋白。

如图1所示,在上述生物以及PMI 转基因植物中,甘露糖经己糖激酶磷酸化生成的甘露糖-6-磷酸,在PMI 的异构作用下生成果糖-6-磷酸,果糖-6-磷酸再进入糖酵解途径(Reed et al .,2001)。

图1　磷酸甘露糖异构酶(P MI )基因转化植株中甘露糖、葡萄糖和果糖代谢Fig.1　M etabolism of mannose ,glucose and fructose in transgenic plants harboringphosphomannose is omerase (PMI )gene HXK:Hex ose kinase ;FRK:Fructose kinase ;PG I :Phosphoglucose is omerase ;PMI :Phosphomannose is omerase ;PFK:Phosphofructose kinase.在甘露糖筛选培养基上,转化与未转化植物细胞中的己糖激酶均能不断将甘露糖转变成为甘露糖-6-磷酸,但只有在转化细胞中PMI 的进一步催化下才能转化成果糖-6-磷酸,继而进入糖酵解途径而被细胞利用,因此转基因细胞可以利用甘露糖作为碳源而正常生长和再生;而非转化细胞由于没有PMI 基因,不能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸,因而不能利用甘露糖作为碳源,且造成体内甘露糖-6-磷酸的积累,抑制糖酵解(Reed et al .,2001),并导致ATP 新陈代谢受阻和磷酸根离子的大量消耗,从而生长受到抑制(Joersbo et al .,1999)。

该选择体系与抗生素或除草剂筛选体系的区别在于抗生素和除草剂直接“杀死”未转化植物细胞,而甘露糖选择体系中的未转化细胞尽管处于“碳饥饿”状态,但不会立即死亡。

在该筛选体系中,转化细胞的生长和再生过程可以利用筛选剂甘露糖,因而被称为正筛选。

2　影响甘露糖筛选体系转化效率的因素甘露糖筛选体系转化效率高于卡那霉素选择体系(Lucca et al .,2001),在金柑(Fortunella crassifolia )上的试验也获得同样结果。

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基因工程技术在农作物生产中的应用

基因工程技术在农作物生产中的应用

基因工程技术在农作物生产中的应用随着科学技术的发展，基因工程技术在农作物生产中得到广泛应用。

基因工程技术可提高农作物的产量、抗逆性及品质，同时也能解决一些疾病，给人们带来更全面、更安全的饮食。

本文将介绍基因工程技术在农作物生产中的应用。

一、基因工程技术的概念基因工程技术，简称基因工程，是一种可以利用生物学、化学、物理学知识研究、创造和改变基因的技术。

通过基因工程技术，人们可以对生物体的遗传信息进行干预和改变，使其获得新的性状，并使生物器官功能得到改善。

二、基因工程技术在农作物中的应用1.提高生长速度和品质基因工程技术可以实现对农作物的基因组进行改造，进而提高其生长速度和品质。

例如，利用基因工程技术可以改变玉米的淀粉性质，使其更易消化，达到优化营养的目的。

同样的，对大米的基因进行改造，可以使其更耐寒、抗旱和抗病，提高农作物的抗逆性能，进而提高大米的产量。

2.降低农药使用量农业生产中，常常因为病虫害的侵袭而使用农药，但常常有害于人体健康，严重的甚至会导致癌症等身体疾病。

通过基因工程技术可以实现植物对虫害的自然防御能力，减少可避免的农药使用量和对环境的影响，使农作物的生产更为健康和安全。

3.提高生产效率和保证食品安全农业生产行业越来越重视食品安全和食品的品质，而通过基因工程技术，能够实现对农作物基因的精细调控，进而实现对农产品中营养的定向培育，并提高生产效率。

三、基因工程技术在农业过程中的作用1.创造更多新的耐逆性物种通过基因工程技术可以改造作物的基因，乃至创建更易适应环境、更耐逆性的物种。

例如，在亚热带地区，柑橘、水稻等作物常受到干旱、涝或贫瘠的土壤的侵害，利用基因工程技术改造作物的基因，可以大幅度提高作物的适应能力，创造更多新的物种。

2.提高农作物品质利用基因工程技术可以有效提高农作物的营养价值、口感及色泽等方面，这样对于消费者而言，其安全和品质得到了更全面的保障，不仅能够保证健康，还能够保证美食享受。

现代生物技术在农作物生产中的应用

现代生物技术在农作物生产中的应用

现代生物技术在农作物生产中的应用现代生物技术是指利用生物学、基因工程、细胞工程等相关技术手段来改良生物体性状的技术。

在农作物生产中，现代生物技术被广泛应用，以提高农作物的产量、抗病虫性和适应性。

以下将分别介绍转基因技术、基因编辑技术和组织培养技术在农作物生产中的具体应用。

首先，转基因技术是指通过人工将外源基因导入到农作物的基因组中，从而使农作物获得特定的性状。

转基因技术可以提高农作物的产量、抗病虫性和耐逆性，从而增加粮食产量。

例如，转基因水稻具有抗旱性和抗病虫性，可以在恶劣环境下保持较高的产量，有助于解决粮食短缺问题。

此外，转基因玉米具有抗虫性，可以减少农药使用量，降低环境污染。

其次，基因编辑技术是指利用CRISPR/Cas9等工具直接编辑农作物的基因组，实现精准的基因修饰。

基因编辑技术具有高效性和精准性，可以避免转基因技术中可能存在的外源基因插入和杂交等问题。

通过基因编辑技术，科学家可以对农作物的特定基因进行精确修改，以获得所需的性状。

例如，利用基因编辑技术可以使水稻具有更高的营养价值，如增加铁、锌等微量元素的含量，从而改善人们的营养状况。

最后，组织培养技术是一种利用植物细胞、组织或器官在无菌条件下培养和再生植株的技术。

组织培养技术可以大幅提高植物种子繁殖的效率，缩短繁育周期，有助于快速选育出优良的品种。

通过组织培养技术，科学家可以实现对植物的快速繁殖、改良和清除病毒等病原体，提高植物种子的质量和数量。

此外，组织培养技术还可以用于农作物的无性繁殖和种质保存，为保护品种资源提供了有效手段。

综上所述，现代生物技术在农作物生产中发挥着重要作用，可以提高农作物的产量、质量和抗病虫性，促进农业的可持续发展。

随着生物技术的不断发展和完善，相信其在农作物生产中的应用将会越来越广泛，为保障粮食安全和促进农业现代化发挥更加重要的作用。

pmi基因作为一种新型的安全选择标记基因的研究进展

pmi基因作为一种新型的安全选择标记基因的研究进展

p m i基因作为一种新型的安全选择标记基因的研究进展3马宏敏1,2,周　会2,黄庭旭1,杨　东1,张水金1(1.福建省农科院水稻研究所,福建福州350019;2.农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福建福州350002)摘　要:p m i基因作为一种新型的安全选择标记基因在植物转基因研究中有着广阔的应用前景。

本文从作用机理、基因来源、安全性评价、实际应用、发展前景和不足等方面对其进行了概述。

关键词:p m i基因;安全标记基因中图分类号:Q343.1　文献标识码:A　文章编号:10089799(2006)02004602 自从1983年第一株转基因植物诞生以来,全球抗虫、抗病、抗除草剂和品质改良的转基因农作物已达120多种,种植面积4700多万h m2。

众所周知,植物遗传转化的频率通常较低,而且必须利用选择标记来保证转化细胞的存活并防止非转化细胞生长。

目前,在植物转基因上应用的筛选体系有很多种,根据其对转化体细胞新陈代谢活动的利弊,可以分为正向筛选体系和负向筛选体系。

负向筛选体系使植物产生抗性的机理是它对抗生素类、除草剂类或其它类似物具有解毒作用,解除它们对植物细胞的毒性,从而使转基因的植物细胞对抗生素等产生抗性,而非转基因的植物细胞对抗生素等敏感而被杀死。

常用的负向筛选体系包括抗生素筛选体系和除草剂类筛选体系等。

虽然这些负向筛选体系目前应用比较广泛,但是也存在着不可忽视的缺陷,如:选择标记基因与目的基因无关,使用抗生素等物质对植物生长有负面影响,抗性标记基因有潜在的生态环境和食用安全性隐患等。

在正向筛选体系中,转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源,可以在筛选培养基上生长,而非转化细胞不能利用筛选剂糖类,处于饥饿状态,生长受到抑制但不被杀死。

近年来,由于正向筛选体系相比负向筛选体系在安全性方面具有优势,因此得到了快速发展。

现在常用的正向筛选体系有绿色荧光蛋白基因(GFP)筛选体系、G US筛选体系、p m i基因/甘露糖筛选体系、木糖筛选体系等。

PMI_甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用

PMI_甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用

第41卷第3期2005年5月林业科学SCIE NTI A SI LVAE SI NIC AE V ol 141,N o 13May ,2005PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用3杨　莉　徐昌杰　陈昆松(浙江大学园艺系农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室　杭州310029)摘　要:　介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(P MI )法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。

P MI 能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。

该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。

目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。

其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。

安全评估结果表明P MI 基因对人体健康和环境无害。

P MI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。

关键词:　磷酸甘露糖异构酶(P MI )基因;甘露糖;植物;转基因中图分类号:S718146;Q94312 文献标识码:A 文章编号:1001-7488(2005)03-0137-05收稿日期:2003-12-09。

基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(G 2000046806),国家自然科学基金(30100125)和浙江省自然科学基金(301291,Z D0004)资助。

3陈昆松为通讯作者。

Application of PMI /Mannose Selective System in Plant G enetic T ransformationY ang Li Xu Changjie Chen K unsong(Department o f Horticulture ,Zhejiang Univer sity The State Agriculture Ministry Laboratory o fHorticultural Plant G rowth ,Development &Biotechnology Hangzhou 310029)Abstract :　A novel selective system ideal for plant trans formation was introduced.The system uses E scherichia coli phosphomannose isomerase (PMI )gene as the selectable marker gene and mannose as the selective agent.PMI is an enzyme catalyzing the conversion of mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate ;the latter can be further metabolized in glycolysis.T rans formed cells can grow normally utilizing mannose as carbon source ,while non-trans formed cells cannot because of non-metabolizable nature of mannose-6-phosphate.The trans formation frequency was affected by genotypes ,sugars other than mannose ,concentrations of phosphate and culture conditions.The system has been evaluated in w oody plants ,sweet orange and grape ,as well as in annual crops and is regarded to be an ideal replacement for traditional antibiotic or herbicide selective systems.Besides general methods for detecting transgenic plants ,plants trans formed with PMI gene can be assayed by enzyme activity analyses.Especially ,the chlorophenol red (CPR )method for PMI activity analysis is sim ple ,reliable ,and need no expensive reagents.The plants trans formed with PMI gene were dem onstrated to be safe to human health and environment.All the results indicate that PMI is an effective selective marker for plant trans formation.K ey w ords :　phosphomannose isomerase (PMI )gene ;mannose ;plant ;genetic trans formation1983年首例转基因作物的问世为人们提供了一种新的育种方法,可将有益基因转入植物而不会改变原有品种的优良性状。