下载文档原格式
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种基因组分析方法，用于确定一些特定DNA序列在细胞或组织中的位置。
该技术可以帮助研究人员了解基因组的结构和功能，以及基因在不同细胞类型中的表达模式。
下面将详细介绍原位杂交技术的操作步骤及一些建议。
操作步骤：1.准备DNA探针：首先需要选择合适的DNA探针，用于与目标DNA序列杂交。
DNA探针可以是标记有荧光分子或放射性同位素的DNA序列，用于在杂交后的图像检测或放射计数。
2.制备标本：从目标细胞或组织中提取DNA，并进行适当的处理步骤以便于杂交反应。
其中的处理步骤包括固定、裂解、脱氧核酸酶处理等。
3.杂交反应：在杂交缓冲液中，加入DNA探针和标本DNA，并进行杂交反应。
杂交条件（包括温度、时间和盐浓度等）会根据探针和目标序列的碱基配对特性进行选择。
对于不同的实验目的，例如检测靶基因在组织中的表达模式，杂交条件需要根据实验要求确定。
4.洗涤：在杂交反应结束后，需要进行洗涤步骤以去除非特异杂交的DNA。
通过在高温、高盐浓度或低温条件下进行洗涤，可以选择性地去除未与目标DNA序列配对的DNA。
5.可视化和成像：根据DNA探针的标记方式，采用不同的方法进行可视化和成像。
对于荧光标记的探针，可以使用荧光显微镜观察，并通过分析图像来确定特定DNA序列的位置。
对于放射性标记的探针，可以使用辐射自显像片、液闪仪或放射计数仪等设备进行检测和计数。
小贴士：1.选择合适的探针：为了获得准确的结果，选择合适的探针非常重要。
探针的特异性和亲和力会直接影响到杂交的特异性和效率。
因此，在设计和合成探针时，需要考虑目标DNA序列的长度、特异性和亲和力等因素。
2.优化杂交条件：杂交条件的优化对于获得准确的结果非常重要。
温度、盐浓度和杂交时间是影响杂交反应的重要因素。
通过调整这些条件，可以增强目标DNA和探针的碱基配对能力，提高杂交特异性和效率。
3.正确选择洗涤条件：洗涤步骤的正确选择可以帮助去除非特异杂交的DNA。
原位PCR和原位RT-PCR操作规程（一）、仪器设备英国Thermo Hybaid原位PCR仪。
（二）、操作流程1、原位PCR步骤1）预处理：（1）切片常规脱蜡；（2）0.2mol/L HCl处理10min；（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；（4）Nase消化组织37℃ 30min；（5）梯度酒精脱水，室温干燥。
2）原位扩增：（1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；（2）PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min；（3）氯仿洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。
3) 原位杂交：（1）加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火5min，42℃杂交过夜。
（2）杂交后用2×SSC洗涤10min，3次，1×SSC洗涤10min，3次；（3）缓冲液洗涤10min，3次；（4）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h；（5）缓冲液洗涤5min，3次；（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。
（7）常规脱水：透明、封固。
2、原位RT-PCR步骤1）预处理：（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸馏水洗；（2）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。
2）原位扩增：（1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；（2）用热启动法进行PCR扩增。
标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。
然后将温度升至95℃，2min。
再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环；（3）扩增结束后，在80℃烤15min～30min。
3）原位杂交：（1）杂交前标本95℃加热3min；（2）加上杂交液，湿盒内50℃过夜；杂交液组成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA，每0．5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。
组织培养再生的步骤一、接种组织培养的接种是指将灭过菌的材料，在无菌的情况下，切成小块，放入培养基的过程。
科研、生产部门的接种工作，多在无菌室或超净工作台上进行，中学可制作接种箱，在箱内进行接种。
接种的方法步骤如下：1、在无菌室或接种箱中放好接种时所需要的酒精灯、贮存70%酒精和棉球的广口瓶、各种镊子、接种针、解剖刀、手术剪、火柴、培养基等。
2、在无菌室或接种箱内用紫外灯灭菌（无菌室照射20～50分钟，接种箱照射15分钟）。
3、放入已灭菌的接种材料（用培养皿盛取）。
同时，操作人员用酒精棉球擦手，并对接种工具用酒精灯火焰烧灼。
4、用手术刀片将材料切割成若干片段，并迅速接种入培养基中。
接种时，锥形瓶（或试管）应斜向火焰，在酒精灯火焰附近操作。
5、材料接种好后，将锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上转动烧一遍，盖好瓶盖，注明材料名称及接种日期。
材料接种后，应置于26～28℃的培养室中进行培养。
二、植株诱导本阶段是组织培养中最重要的一环。
在培养基中植物激素的作用下，外植体通过三条途径迅速增殖，这就是侧芽增殖、诱导不定芽的形成和诱导胚状体的形成。
1、侧芽增殖种子植物的每个叶腋中通常都存在着腋芽，在一定条件下可以使它生长。
现在知道顶端优势抑制侧芽生长，可被外源的细胞分裂素打破，所以在利用侧芽增殖这条途径时，培养基中几乎都要加入细胞分裂素（有时也加入少量生长素）。
由于细胞分裂素的持续作用，侧芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛。
如果反复切割和转移到新的培养基上继代培养，就可在短期内得到大量的芽。
侧芽增殖的主要优点是能保持遗传的稳定性，因为茎尖的细胞常是均一的二倍体细胞，它不易受培养条件的影响而发生变异，也易于保持嵌合体的性状。
目前已有近百种植物可以用这种方法进行繁殖，如草毒、苹果、葡萄、唐菖蒲、非洲菊、月季、甜菜和凤梨等。
关于培养基中加入细胞分裂素的浓度，是0.1～10.0毫克/升，一般为1.0～2.0毫克/升。
在几种细胞分裂素中用的最多的是6-苄基嘌呤，其次是激动素和异戎基腺苷，玉米素用的很少。
皮肤原位再生复原技术治疗压疮一、近年来局部治疗观念逐渐以“湿润愈合”替代“干燥愈合”。
湿润暴露疗法(MEBT)/湿润烧伤膏(MEBBO)是治疗烧伤、创伤和溃疡的重要方法之一。
湿润暴露疗法(MEBT)/湿润烧伤膏(MEBBO)对各种皮肤溃疡,特别是糖尿病足溃疡的治疗具有明显疗效。
二、适应证:目前,湿润暴露疗法(MEBT)/湿润烧伤膏(MEBBO)已广泛应用于烧伤、各种创伤及溃疡(如糖尿病溃疡、血管性溃疡、压疮、皮肤损伤、肛肠疾病、口腔溃疡、宫颈糜烂、冻疮等),皮肤病(如带状疱疹、尿布皮炎等)等治疗中,并取得良好治疗效果。
三、特点:临床实践证实,该技术具有“疗效可靠,操作简便,价格低廉,临床实用性强,易于各级临床医疗机构推广应用”等特点,能更好地服务于临床,使更多患者受益。
四、湿润烧伤膏(MEBO)药纱的制作将纱布裁剪成 5.0cm×5.0cm的单层小块,当然,有时候需根据压疮隧道大小或创面的大小来进行裁剪,常规消毒,依次平整地置入圆角器械盘内,每两层纱布均匀涂抹厚约2mm的MEBO,最后将器械盘放入蒸汽消毒锅中熏蒸10min,取出、备用。
五、湿润烧伤膏(MEBO)药纱治疗压疮的方法(1)创面处理采用湿润烧伤膏联合外科清创术治疗。
清除创面坏死皮肤及皮下组织后将湿润烧伤膏均匀抹于创面(小创面不需制作药纱,直接将药涂抹即可;较大创面且有隧道时将药纱轻轻堵塞压疮隧道。
),每6h换药一次;待创面洁净后用外科缝合术闭合创面,并在闭合口两端置入冲洗管和引流管,压疮腔隙在3cm×5cm以下的,每日冲洗1~2次即可,腔隙较大者24h持续冲洗,1~2周后逐步拔出部分冲洗管和引流管,直至腔隙完全闭合,缝合后的创面外涂湿润烧伤膏换药治疗,每6h换药一次,直至创面愈合。
(2)全身治疗根据患者原发病情况给予相应的系统治疗,包括营养支持、纠正胝蛋白血症、全身应用抗生素、活血化瘀、降血糖等。
(3)疗效判定依照国际NPUAP和EPUAP制订的压疮治疗指南,应用创口尺测量患者压疮创面面积,每周测量1次;以90d为治疗压疮的治疗判定终点。
