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多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
多克隆抗体的制备技术
多克隆抗体的制备技术是一种利用多个B细胞克隆的方法，用于生产特定抗原的抗体。
具体步骤如下：
1. 抗原制备：首先，需要制备抗原。
抗原可以是蛋白质、病原体、多肽或其他分子，可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达、纯化或合成。
2. 免疫小动物：将制备好的抗原注射到小动物体内（如小鼠、兔子或大鼠）作为免疫原。
这样做可以激发动物的免疫系统产生抗原特异性的抗体。
3. 收集抗体：收集免疫小动物产生的抗原特异性抗体。
一般情况下，可以通过静脉采血或收集腹水来获得抗体。
4. 抗体纯化：对采集到的抗体进行纯化，可以使用亲和层析或离子交换层析等技术进行精确的纯化。
5. 克隆：将纯化的抗体进行多次稀释，然后分别稀释至单个细胞级别。
接下来，将单个细胞分别种植在含有培养液的孔中，使其形成克隆。
6. 验证：对每个克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他检测方法验证抗体的特异性和亲和力。
7. 扩大培养：对验证合格的克隆进行扩大培养，使其产生大量的抗体。
通过以上步骤，可以制备出多个来自不同克隆的抗体，这些抗体可以与同一抗原结合，用于生物学研究、诊断和治疗等领域。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报双抗体阻断ELISA 检测小反刍兽疫病毒抗体的方法建立摘 要：小反刍兽疫病毒（PPRV ）的N 蛋白是血液中此病毒抗体的主要靶蛋白，本研究克隆并表达N 蛋白，将纯化后的N 蛋白免疫新西兰大白兔来制备多克隆抗体，采用饱和硫酸铵沉淀法收集多克隆抗体，再用辣根过氧化物酶标记此抗体。
用纯化的N 蛋白包被96孔板，酶结合物多克隆抗体作为检测抗体，建立了检测小反刍兽疫病毒双抗体阻断ELISA 方法，经过反复优化，N 蛋白的最佳包被浓度为3.0 μg/mL ，酶结合物抗体的最佳稀释比例为1∶800，利用本研究确定的方法对200份血清样本进行检测，符合率为95%（169/200），本研究确定的方法可用于检测血清中PPRV 的抗体水平，为今后小反刍兽疫的防控和疫苗效果的检测提供基础。
关键词：小反刍兽疫；双抗体阻断ELISA ；N 蛋白；多克隆抗体中图分类号： S852.4文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）01-0061-05Development of a Double Antibody Blocking ELISA for Detecting PPRV AntibodiesYUAN Xuetao, WANG Fangrui, SHI Yu, YANG Aihua(Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center, Tianjin 301700, China)收稿日期：2021-11-02基金项目：天津市农业发展服务中心青年科技创新项目（Zxkj202104）作者简介：袁雪涛，女，硕士，主要从事动物疫病血清学检测工作通信作者：袁雪涛，E-mail:****************Abstract: The N protein of Peste des petits ruminants virus (PPRV) is the major target protein in the blood of relevant animals. The gene coding for N protein was cloned for expression in the present study. Then the expressed N protein was purifi ed and used to immunize rabbits. The specifi c polyclonal antibodies (PAbs) were purifi ed using saturated ammonium sulfate precipitation method and then labeled with horseradish peroxidase (HRP). Development of a double antibody blocking ELISA method was carried out by using the purifi ed N protein as coating antigen for 96-well plates and PAb-HRP conjugate as detector. The optimal parameters included the coating antigen concentration at 3.0 μg/mL and PAb-HRP conjugate dilution at 1:800. Total 200 serum samples were tested and 95% (169/200) agreement was obtained. In conclusion, this ELISA method developed in this study could be utilized for detecting PPRV antibodies in serum samples, which would be useful in prevention, control and vaccine effi ciency studies.Key words: Peste des petits ruminants; blocking ELISA; N protein; polyclonal antibody2023,31(1):61-65袁雪涛，王芳蕊，石 瑜，杨爱华（天津市动物疫病预防控制中心，天津301700）小反刍兽疫（ p este des petits ruminants, PPR）是一种由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV）引起的急性传染病，又名小反刍兽假性牛瘟（pseudorinderpest），属于副黏病毒科（paramyxoviridae）中的麻疹病毒属（morbillivirus ），形状不定，但大多数情况下表现为球形，相比于牛瘟病毒（Rinderpest virus）颗粒来说，一般颗粒体积较大，它是一种单链负链RNA病· 62 ·中国动物传染病学报2023年2月毒，核衣壳由N蛋白组成，N蛋白相对保守，具有较强的免疫原性，主要在小反刍动物中流行，包括绵羊、山羊等，发病的主要特征为发热、肺炎、腹泻和口炎，本病主要在非洲的中西部以及亚洲的部分地区流行，亚洲地区包括印度、尼泊尔、巴基斯坦等国家[1-3]，而我国首次发现小反刍兽疫是2007年7月在西藏的阿里地区，革吉、日土、扎达和改则4个县均出现疫情[4]，此后在国内的多个省暴发过小反刍兽疫，比如湖南省、内蒙古自治区、辽宁省、吉林省、山东省、重庆、新疆维吾尔自治区等，疫情的暴发给相关行业带来了巨大的经济损失[5]，由于小反刍兽疫具有高发病率和高死亡率的特点，我国政府乃至国际社会都非常重视此兽疫的预防、发现和扑灭，并将小反刍兽疫列为国家一级动物疫病，是国家疫病的重点防治对象。
山羊痘病毒ｐ３２基因的克隆、表达及单克隆抗体制备王永志１，３，苏颖１，米丽娟２，付云红２，范志强３，扈荣良３，赵玉民１（１．吉林省农业科学院，吉林长春 １３０１２４；２．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 １３０１１８；３．中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 １３００６２）摘要：本研究旨在表达山羊痘病毒ｐ３２蛋白、制备ｐ３２蛋白单克隆抗体。
通过ＰＣＲ克隆ｐ３２基因，连接到ｐＭＤ１８－Ｔ并测序；酶切、连接后将ｐ３２基因克隆到ｐＥＴ２８ａ（＋）中，将重组质粒转化大肠杆菌Ｒｏｓｓｅｔａ，在ＩＰＴＧ诱导下成功表达ｐ３２蛋白；利用亲和层析法纯化ｐ３２蛋白，用纯化蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后制备ｐ３２蛋白单克隆抗体，获得２２株识别重组蛋白的单抗，通过间接免疫荧光鉴定，其中３株能识别病毒的ｐ３２蛋白。
山羊痘病毒ｐ３２蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。
关键词：山羊痘病毒；ｐ３２基因；单克隆抗体中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２０１１）０９－０１０１－０４ 羊痘（ｃａｐｒｉｐｏｘ，ＣＰ）是由羊痘病毒（ｃａｐｒｉｐｏｘ－ｖｉｒｕｓ，ＣＰＶ）引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病（殷震等，１９９７）。
ＣＰＶ为痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、羊痘病毒属的成员。
羊痘被认为是所有动物痘病中最严重的一种，由于ＣＰＶ不同毒株的毒力不同，ＣＰＶ对易感羊群的致死率达１０％～５８％或７５％～１００％（Ｂａｌｉｎｓｋｙ等，２００７），妊娠母羊感染后极易流产，羔羊致死率高达１００％，受感染羊群的生产力极大降低，皮毛品质也大大下降，造成巨大经济损失，严重影响养羊业的发展（Ｂｈａ－ｎｕｐｒａｋａｓｈ等，２００６）。
羊痘在非洲中北部、亚洲中部和西南部及印度大部分地区呈地方性流行，中国及周边国家均有本病的发生（Ｂａｂｉｕｋ等，２００８）。
近年来，羊痘在中国黑龙江、吉林、河北、福建、甘肃、贵州、江西、青海和内蒙古等省均有流行（赵志荀等，２００９）。
ＣＰＶ基因组大小为１４３～１４７ｋｂ，含有１４７个ＯＲＦｓ。
ｐ３２位于ＣＰＶ基因组的６４～６５ｋｂ处（Ｔｕｌｍａｎ等，２００２），由第７４号ＯＲＦ编码，是位于ＣＰＶ膜表面的一种主要结构蛋白（Ｚｉｎｏｖｉｅｖ等，１９９４），并且与病毒的毒力相关，分子质量为３２ｋｕ；为羊痘病毒属所特有，免疫原性强的结构蛋白，含有收稿日期：２０１１－０１－２１作者简介：王永志（１９７８―），男，吉林人，博士，副研究员，研究方向：病原微生物。
通信作者：赵玉民（１９６５―），男，吉林人，博士，研究员，研究方向：畜牧兽医。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｙｍ－０２－１２＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：０４３１－８７０６３００７基金项目：吉林省农业科学院博士科研启动基金（０１００４３４）。
重要的抗原决定簇。
研究结果发现，ＣＰＶ感染后，ｐ３２蛋白首先引起抗体反应，然后才产生其他结构蛋白的抗体反应；用重组ｐ３２蛋白为抗原，辅以佐剂来免疫动物，虽然不能阻止病毒在攻毒部位增殖，但可以阻止病毒向其他部位扩散，减轻发病羊的病理变化，也可以降低死亡率，但是ｐ３２蛋白具有一定的细胞毒性，对免疫部位有损伤。
绵羊痘病毒、山羊痘病毒的ｐ３２基因的阅读框分别由９７２、９６９ｂｐ的碱基组成，编码３２３、３２２个氨基酸。
国内外学者对ｐ３２基因进行了同源性比较，发现它们在基因组成上高度保守，在核苷酸水平上同源性为９７．５％，在氨基酸水平上同源性为９４．７％。
两者ｐ３２基因最主要的区别是在绵羊痘病毒ｐ３２序列中的５５位是天冬氨酸，而在山羊痘病毒中此位置处均无此氨基酸（Ｈｏｓａｍａｎｉ等，２００４；马维民等，２００６）。
目前，羊痘的诊断主要依靠临床经验判断，国内还没有科学的羊痘病毒抗原、抗体检测方法；对羊痘抗体、抗原的快速检测对羊痘的预防具有重要的指导意义。
为此，本研究表达了山羊痘病毒（ｇｏａｔｐｏｘｖｉｒ－ｕｓ，ＧＰＶ）ｐ３２蛋白，并制备了ｐ３２蛋白的单克隆抗体，为建立羊痘抗体、抗原检测方法提供生物材料。
１ 材料与方法１．１ 毒株、载体及主要试剂 山羊痘病毒疫苗株、ＢＨＫ－２１细胞、原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０和Ｒｏｓｓｅｔａ均由军事医学科学院军事兽医研究所流行病学研究室保存。
限制性内切酶、ｐＭＤ１８－Ｔ载体、Ｔ４ＤＮＡ连接酶为大连宝生物工程有限公司产品，凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，Ｔａｑ ｐｌｕｓＤＮＡ聚合酶为上海中科开瑞生物芯片科技有限公司产品，ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ和羊抗鸡ＩｇＧ购自ＫＰＬ公司，ＭＥＭ培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司，Ｎｉ ２＋－ＮＴＡ琼脂糖凝胶镍柱购自ＱＩＡＧＥＮ公司，异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）和抗生素购自上海生工生物工程有限公司。
１．２ 山羊痘病毒ｐ３２基因的克隆 根据ＧｅｎＢａｎｋ登录序列设计了ｐ３２基因特异性引物，上游引物：５′－ＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＴＡＴＧ－３′（下划线处为ＮｃｏⅠ），下游引物：５′－ＡＴＣＴＣ－ＧＡＧＴＣＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＴＣ－３′（下划线处为ＸｈｏⅠ）。
取山羊痘疫苗１００μＬ于１ｍＬ四蒸水中煮沸１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清作为模板，用Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶扩增ｐ３２基因。
反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ；９４℃变性１５ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，进行３０个循环；７２℃再延伸１０ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物经凝胶纯化回收，与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化大肠杆菌Ｔｏｐ１０感受态细胞，经ＰＣＲ鉴定和测序分析获得重组质粒ｐＭＤ－ｐ３２。
１．３ ｐ３２基因原核表达载体的构建 用ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切重组质粒ｐＭＤ－ｐ３２和原核表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋），凝胶纯化回收目的片段，将山羊痘病毒的ｐ３２基因与ｐＥＴ２８ａ（＋）连接，构建重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ｐ３２，转化大肠杆菌Ｔｏｐ１０，经ＰＣＲ鉴定和酶切鉴定后，送上海博亚生物技术有限公司测序。
１．４ 重组ｐ３２蛋白的表达与鉴定 将山羊痘病毒ｐ３２基因重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ｐ３２转化至大肠杆菌Ｒｏｓｓｅｔａ，挑取单个菌落进行鉴定后扩增，采用不同的ＩＰＴＧ浓度、诱导时间、诱导温度、诱导前Ｄ６００ｎｍ值、培养基抗生素浓度进行诱导表达，优化诱导条件，比较不同表达条件的表达量，确定最佳诱导条件，同时设立含ｐＥＴ２８ａ（＋）空载体的表达菌作为对照。
收集菌体蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳验证表达情况。
重组蛋白用鼠抗羊痘病毒血清和ＨＲＰ标记羊抗鼠ＩｇＧ做Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定。
１．５ 重组ｐ３２蛋白的纯化 采用优化的表达条件进行大量表达，收获菌体，冻融３次，用ＰＢＳ悬浮菌体沉淀，４℃条件下４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，包涵体沉淀用３ｍｏｌ／Ｌ尿素溶液洗去大部分杂质蛋白，４℃条件下４５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，包涵体沉淀用ｐＨ ８．０含８ｍｏｌ／Ｌ尿素的裂解液室温溶解１ｈ，４℃条件下１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清与Ｎｉ ２＋－ＮＴＡ填料结合１ｈ，分别用ｐＨ ８．０、６．３、５．９的８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶液洗涤去杂蛋白后，用ｐＨ ４．５的８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶液洗脱目的蛋白，收集洗脱的目的蛋白，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定。
用紫外分光光度计测定纯化蛋白的浓度。
１．６ ｐ３２单克隆抗体的制备１．６．１ 小鼠免疫 分别将纯化的ｐ３２重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合、乳化，免疫６～８周龄ＢＡＬＢ／ｃ纯系小鼠５只。
首免以弗氏完全佐剂乳化抗原，腹腔注射，每只５０μｇ（０．２ｍＬ）；间隔２０ｄ，用弗氏不完全佐剂乳化抗原进行第二次免疫，腹腔注射，每只５０μｇ（０．２ｍＬ）；免疫１５ｄ后，尾静脉采血，以ｐ３２重组蛋白为检测抗原，用间接ＥＬＩＳＡ方法测定免疫小鼠血清的抗体水平。
免疫合格的标准是免疫小鼠抗体滴度达到１∶４０００以上，表明小鼠获得良好免疫效果。
免疫合格后，用不加佐剂的ｐ３２重组蛋白进行三免，肌肉注射，每只１００μｇ（０．２ｍＬ），３ｄ后做脾细胞融合。
１．６．２ 细胞融合 免疫小鼠经眼眶放血，收集血清，拉颈致死后，无菌取小鼠脾脏，分离脾细胞，经台盼兰染色计数，按５∶１的比例与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞（２×１０７个）混合，在ＰＥＧ ４０００作用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用ＨＡＴ选择培养基重悬，置５％ＣＯ２、３７℃进行选择性培养，５ｄ后半量换液，１０ｄ后改为ＨＴ培养基。
待细胞克隆长至１／５～１／２培养孔时，吸取细胞培养上清检测分泌抗体。
１．６．３ 杂交瘤细胞筛选 以纯化的ｐ３２重组蛋白为检测抗原，对杂交瘤细胞分泌的抗体进行ＥＬＩＳＡ检测，筛选阳性杂交瘤细胞。
用０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸盐包被缓冲液（ｐＨ ９．６）稀释纯化的ｐ３２重组蛋白，加入酶标板，１００μＬ／孔，３７℃包被１ｈ后转入４℃包被过夜；用含０．０５％吐温－２０的ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）洗涤３次，加含５％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ于３７℃封闭１ｈ，每孔加入杂交瘤细胞培养上清１００μＬ，３７℃孵育２ｈ；ＰＢＳＴ洗３次，加入１∶５０００稀释的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记羊抗鼠ＩｇＧ，３７℃孵育１ｈ，ＰＢＳＴ洗４次，加入显色底物ＯＰＤ－Ｈ２Ｏ２，避光反应１０ｍｉｎ后，用２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４终止反应，用酶标仪读取Ｄ４５０ｎｍ值，与阴性对照Ｄ４５０ｎｍ值的比值大于２．１判为阳性。
１．６．４ 有限稀释法对阳性孔细胞进行克隆化及鉴定 用ＨＴ培养基制备阳性杂交瘤细胞悬液，取样进行台盼兰染色和计数；以ＨＴ培养基将杂交瘤细胞稀释至２０／ｍＬ和１０／ｍＬ，将稀释细胞悬液分别加入９６孔培养板，每孔０．１ｍＬ，细胞含量分别为２个／孔和１个／孔，置５％ＣＯ２、３７℃培养，５～７ｄ观察细胞克隆生长情况，选取单克隆生长孔细胞上清，以重组ｐ３２蛋白为抗原，用间接ＥＬＩＳＡ检测分泌抗体；甲醛固定山羊痘病毒感染的ＢＨＫ－２１细胞，通过间接免疫荧光（ＩＦＡ）鉴定ＥＬＩＳＡ检测为阳性的杂交瘤细胞上清；以重组ｐ３２蛋白为抗原，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定ＩＦＡ检测为阳性的杂交瘤细胞上清。
２ 结果２．１ 山羊痘病毒ｐ３２基因膜外区序列的克隆 用特异性引物从山羊痘疫苗中通过ＰＣＲ扩增，得到约８８２ｂｐ的基因片段（图１），与ｐ３２基因膜外区大小一致。
连接至载体ｐＭＤ１８－Ｔ，阳性质粒测序结果表明，所得ｐ３２基因膜外区的序列和读码框都正确无误。
图１ ｐ３２基因ＰＣＲ扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析注：Ｍ，ＤＮＡ分子质量标准；１，ｐ３２基因的ＰＣＲ产物；２，阴性对照。
２．２ ｐ３２基因原核表达载体的构建 将测序正确的ｐ３２基因克隆入表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）中，成功地构建了ｐＥＴ２８－ｐ３２重组质粒。
