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收稿日期：2008-05-13基金项目：中国科学院创新项目（KZCX2-YW-407）；中国科学院野外台站基金项目和国家科技支撑计划课题（2006BAD05B01作者简介：毕明丽（1984－），女，在读硕士，从事土壤肥力与养分循环研究。
E-mail:bi-yours@ *通讯作者：E-mail:wtyu@农田生态系统微生物多样性研究方法及应用毕明丽，宇万太*（中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳110016）摘要：微生物在农田生态系统中占据着很重要的作用，其结构和功能的多样性及变化在一定程度上反映了农田生态系统的基本状态，因此非常有必要应用有效的方法来研究农田微生物的多样性、分布及行为等。
但是通过传统的微生物培养和鉴定方法得到的微生物信息很片面，不足以代表微生物在农田生态系统中的真实情况。
而近几十年来兴起的微生物研究新方法突破了传统方法的限制，极大地促进了微生物学的发展。
本文介绍了现在常用的微生物多样性研究方法及其在农田生态系统中的应用现状。
关键词：微生物多样性；研究方法；分子生物学；农田生态系统中图分类号：S153.6文献标识码：A文章编号：0564-3945(2009)06-1460-07Vol.40,No.6Dec.,2009土壤通报Chinese Journal of Soil Science第40卷第6期2009年12月微生物是农田生态系统的重要组成部分，在动植物残体分解、养分循环、氮的固定、土壤结构与肥力保持和病虫害防治等方面都起着很重要的作用[1]，微生物的多样性和群落结构在一定程度上反映了农田生态系统的基本状况，保持微生物的生态过程和多样性是农业生产赖以生存的基础。
通过研究农田生态系统中微生物的分布和多样性，探讨农田生态系统的影响因素及其作用机理，可以为今后制定农业管理计划提供科学依据，具有很重要的理论和实践意义。
农田生态系统中微生物种类极其丰富，文献记载1g 农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子、数万个原生动物和藻类[2]，它们在农田生态系统中起着至关重要的作用。
PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用摘要：PCR-DGGE技术目前已被广泛应用于环境微生物领域。
介绍了PCR-DGGE技术的原理及其优点，概述了PCR-DGGE技术在环境工程废水微生物处理中的应用，分析了PCR-DGGE技术用于生物处理系统中微生物群落多样性和动态性研究的现状，并展望了其应用前景。
关键词：PCR-DGGE技术；微生物；应用变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是目前研究微生物群落结构主要分子生物学方法之一[1]。
该技术系由Fischer和Lerman于1979年最先提出一种用于检测DNA突变电泳技术，该技术使传统琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分辨精确度提高至一个核苷酸残基差异水平。
Muyzer等在1993年首次将DGGE电泳检测技术应用于微生物群落结构研究，并指出该技术在揭示自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优势。
DGGE技术能快速、准确鉴定自然环境或人工环境中微生物种群，并能揭示复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位和表达调控的评价分析，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域。
1 PCR-DGGE技术原理DGGE技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对DNA进行电泳，该凝胶电泳时能够有区别地解链PCR扩增产物。
在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的DNA双链的解链需要不同的变性剂浓度。
序列不同的DNA片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。
起初双链DNA以现状向正极移动，随着变性剂浓度的增加，DNA中具有低G+C含量的序列的部分被打开，而高G+C含量的部分仍保持双链。
DNA双链一旦解链，DNA分子形成端部的叉状或中间的环节（即DNA部分熔化）。
其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。
黑龙江农业科学2010(7):5~8Heilong jiang Ag ricultural Sciences生物技术DGGE 技术在土壤微生物群落研究中的应用宋 洋,李柱刚(黑龙江省农业科学院生物技术研究所/黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室,黑龙江哈尔滨150086)摘要:现代分子生物学的变性梯度凝胶电泳(Denatur ing G radient Gel Electr qphoresis,DGG E)技术是土壤微生物群落研究的有效工具,它直接分离土壤微生物的DN A 片段,比传统的培养方法更具明显的优势,已成为研究土壤微生物的重要手段之一。
对DG GE 技术的原理及其在土壤微生物群落研究中的应用情况、优点和局限性进行了介绍。
关键词:DG GE;土壤微生物;群落结构中图分类号:Q 938 1+5 文献标识码:A 文章编号:1002 2767(2010)07 0005 04收稿日期:2010 03 22基金项目:黑龙江省科技厅国际合作重点资助项目(WB 07A10)第一作者简介:宋洋(1981 ),女,黑龙江省哈尔滨市人,硕士,研究实习员,主要从事微生物菌群分析和分子育种研究。
E mail:achievement81@yahoo com cn 。
通讯作者:李柱刚(1972 ),男,黑龙江省庆安县人,博士,研究员,从事植物分子育种研究。
E mai l:lizhugang@163 com 。
土壤中微生物群落结构对农业的健康、持续发展具有重要作用。
它们积极参与土壤物质转化过程,在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构形成与改良、有毒物质纯化及净化方面起着重要作用[1]。
由于土壤微生物的重要性,有关土壤微生物的群落结构及多样性研究受到广泛重视[2]。
但研究结果表明,土壤微生物中可用常规方法分离培养的微生物只占0 1%~1 0%[3]。
因此,传统的微生物培养及鉴定方法不足以反映土壤环境中微生物的真实情况,需要现代分子生物学技术进行补充,如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)等技术,这些技术可以根据微生物的DNA 序列遗传多态性,揭示出其群落结构及其多态性。
第23卷第8期2003年8月生 态 学 报A CTA ECOLO G I CA S I N I CA V o l .23,N o.8A ug .,2003PCR -D GGE 技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用罗海峰,齐鸿雁,薛 凯,张洪勋(中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究室,北京 100085)基金项目:国家“十五”科技攻关重点项目(2001BA 903B )收稿日期:2003201213;修订日期:2003204201作者简介:罗海峰(1975～),男,陕西凤翔人,博士生,主要从事环境微生物分子生态学研究。
E 2m ail :luo 2222@ho tm ail .comFoundation ite m :T he N ati onal Key Science and T echno logy P ro ject (N o .2001BA 903B )Rece ived date :2003201213;Accepted date :2003204201Biography :LUO H ai 2Feng ,Ph .D .candidate ,m ain research field :mo lecular eco logy of environm ental m icro 2o rganis m .摘要:变性梯度凝胶电泳技术(D GGE )在微生物生态学领域有着广泛的应用。
研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA ,并以此基因组DNA 为模板,选择特异性引物F 357GC 和R 518对16S rRNA 基因的V 3区进行扩增,长约230bp 的PCR 产物经变性梯度凝胶电泳(D GGE )进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。
结果说明,D GGE 能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA 基因的V 3区的DNA 扩增片断进行分离,为这些DNA 片断的定性和鉴定提供了条件。
PCR -DGGE 技术及其在微生物生态学中的应用张宝涛1,王立群13,伍宁丰2,石鹏君3(1.东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030;2.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;3.中国农业科学院饲料研究所,北京100081)摘要:现代分子生物学技术PCR -DGGE 是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究生态系统中微生物多样性和群落动态性。
本文简要介绍了PCR -DGGE 技术原理及其在微生物生态学领域的应用,并对该技术的局限性进行了评价。
关键词:PCR -DGGE ,微生物生态学,现代分子生物学技术,微生物多样性,微生物群落动态性中图分类号:Q93811 文献标识码:A 文章编号:1672-5565(2006)-03-132-04收稿日期:2005-10-24;修回日期:2005-10-29作者简介:张宝涛(1980-),男,山东人,硕士研究生,主要从事环境微生物和应用微生物的研究.E -mail :jonbob @ 3通讯作者:王立群,男,黑龙江省人,教授,主要从事应用微生物学研究。
E -mail :W angliqun2@Application of PCR -D GGE in microbial ecologyZH ANG Bao -tao 1,W ANGLi -qun13,W U Ning -feng 2,SHI Peng -jun3(1.College o f life science ,Northeast Agricultural univer sity ,Harbin 150030China ;2.Biotechnology Research Institute Chinese Academy o f agricultural Sciences.Beijing 100081China ;3.Feed Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China )Abstract :As a m odern m olecular technology ,PCR -DGGE is a power ful tool for the analysis of microbial communities ,which can be used to study the diversity and dynamics of microbial communities.The principle and the application of PCR -DGGE in microbial ecology is briefly in 2troduced ,while the limitations of this technique are evaluated in this paper.K ey Words :PCR -DGGE ;microbial ecology ;m odern m olecular technology 在微生物生态研究中,准确地分析测定微生物群体的类型和数量是非常重要的,因为微生物个体微小,结构简单,缺乏明显的外部特征,且难以依据生理生化特征进行分类鉴定。
南京农业大学学报2005,28(3):53~57J ournal of N anj i ng A gricult ural Uni ver sity应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测农田土壤微生物短期动态变化赵勇1,3,李武2,周志华2,潘迎捷3,赵立平2*(11南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095;21上海交通大学生命科学技术学院,上海200240;31上海水产大学食品学院,上海200090)摘要:在一块农田里于一个月内连续采集5次土样,提取土样微生物总DNA,应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测土壤微生物的动态变化。
结果表明,细菌16S rDNA和真菌18S r DNA的PCR-RFLP图谱在5个采样时间点上基本一致;细菌的PCR-TGGE图谱平均有40条带,其相似性在90%以上,真菌的平均有20条带,其相似性在70%以上。
说明这块农田土壤细菌区系短期内变化不大,而真菌区系存在较小幅度的动态变化,并且细菌多样性远远高于真菌多样性。
比较两种分子生物学方法的结果表明,PCR-TGGE技术比PCR-RFLP技术更能精确地反映土壤微生物的动态变化,并且能同时快速地对多个样品进行有效区分。
关键词:土壤微生物;动态变化;土壤DNA提取;PCR扩增;RFLP分析;TGG E分析中图分类号:Q938文献标识码:A文章编号:10002030(2005)03005305Preli m i nary study on s hort-ter m dyna m ics of agricultural soilm icrobi al co mm unity by PCR-RFLP and PCR-TGGE techni quesZ HAO Yong1,3,L IW u2,ZHOU Zh-i hua2,P AN Y ing-jie3,Z HAO L-i ping2*(11Co llege of L ife Sciences,N anji ng A g ricu ltura lU n i versity,N anji ng210095,Chi na;21Schoo l o f L ife Sc i ences and B i o techno l ogy,Shanghai Jiaotong U n i versity,Shangha i200240,China;31Co llege of Food Sc i ences,Shangha i F ishe ries U niversity,Shangha i200090,Chi na)Abstrac t:W e st udied the sho rt-te r m dyna m ics of agr i cultural so ilm icrob i a l comm un it y by PCR-RFLP and PCR-TGGE techn i ques. T he results show ed t hat t he PCR-RFLP patte rns of bac teria l16S rDNA and fungal18S rDNA w ere si m ilar a m ong5so il sa m ples wh ich we re conti nua lly samp l ed from a fie l d i n one m ont h,the si m ilar ity o f bacter i a l community PCR-TGGE pa tterns w ere up to 90%,w it h40bands ave rage l y pe r samp l e,and that of funga l co mmunity w ere up t o70%,w ith20bands average l y per sa m ple.It de m onstrated that i n t h i s field so il bac terial co mmunity w as re l atively stab l e i n short-ter m per i od,wh ile fungal co mmun ity had so m e ex tent changes,and bacteria l d i versity w as far g rea ter t han that of f ung.i It a l so m an ifested tha t PCR-TGGE is super i or to PCR-R FLP f o r deta il dyna m i cs of so ilm icrobia l community,and it is a rapid m ethod to d i scri m i nate mu lti ple sa mp les si m ultaneousl y.K ey word s:so il m icroo rganis m s;dyna m i cs;so il DNA ex tracti on;PCR a m plifi cation;RFLP ana l ys i s;TGGE ana l ysis对于农田土壤微生物的研究,传统上是采用分离培养的方法,然而已往的研究表明,土壤中只有大约011%~1%的微生物是可培养的[1]。
因此,不经培养直接从土壤样品中提取微生物总DNA进行分析的分子生物学方法被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[2]。
M arti n-Laurent等[3]应用PCR-RFLP技术比较了3种不同土壤微生物的组成差异,Cheung等[4]应用PCR-TGGE技术研究了石油污染土壤中分枝杆菌(M y cobacterium)的多样性。
关于土壤微生物的分子生态学研究,国内起步较晚。
陈灏等[5]、罗海峰等[6]都应用PCR-DGGE技术对不同农田土壤微生物种类分布进行了初步研究。
而应用分子方法对农田土壤微生物动态变化的研究,国内未见报道。
本研究应用基于DNA的两种分子方法(PCR-RFLP及PCR-TGGE技术)监测了同收稿日期:20041024基金项目:上海市农委资助项目(2002442;2003152)作者简介:赵勇(1975),博士研究生。
*通讯作者C orres pondi ng au t hor:赵立平(1962),教授,博导,主要从事微生物基因组学与分子生态学研究m ai:l l p z hao@s jt u1edu1cn。
一块农田中土壤细菌区系和真菌区系在一个月内的动态变化,旨在为农田土壤微生物的分子生态学研究提供基础资料。
1 材料和方法111 土壤样品采集采样地点:上海交通大学闵行校区东区外围农田。
采样时间:2004年4月1日、8日、15日、22日、29日上午10:00(样品编号依次为1、2、3、4、5)。
采样期间,农田闲置,未耕种;采样时天气晴好,平均气温22e 。
采样方法:在农田4个角及中心共5个点采样,取0~10c m 表层土壤,过20目筛(孔径019mm ),将5个点的土样等量混匀后,在实验室内室温放置24h ,进行土壤总DNA 提取。
土壤性质:泥沙土,持水量为45%,p H 值为(518?012)。
112 土壤DNA 提取及纯化试验在室温条件下进行。
称取015g 土样,置于10m L 灭菌离心管中,加3mL TE NP buffer (50mmo l #L -1Tris ,20mm o l #L -1EDTA,100mm ol #L -1NaC ,l 0101g #m L -1P VPP ,p H 10),旋涡震荡10m i n ,12000r #m i n -1离心5m i n ,弃上清液。
在土壤颗粒沉淀中再加3mL TENP buffer ,按上述方法再洗涤2次,最后加3mL PBS buffer (8g NaC,l 012g KC ,l 1144g Na 2H PO 4,0124g KH 2PO 4,溶于1L 灭菌去离子水中,pH 714)洗涤1次。
在洗涤好的土样中加入0135g 灭菌玻璃珠(直径约1mm )和2mL DNA extracti o n buffer (100mm ol #L -1Tr i s ,100mm o l #L -1EDTA,200mmo l #L -1N aC,l 2%P VPP ,3%CTAB ,p H 910),高强度旋涡震荡10m i n ,再加入500L L 溶菌酶(100m g #mL-1),高强度旋涡震荡5m i n ,37e 水浴30m i n (每隔10m in 用手上下颠倒离心管3次)。
水浴结束后温和旋涡震荡5m i n ,再加入2mL SDS buffer (100mm o l #L -1Tris ,200mm ol #L -1NaC ,l 3%SDS ,p H 910),用手上下颠倒5m i n ,65e 水浴30m i n (每隔10m i n 用手上下颠倒离心管3次),8000r #m i n -1离心15m in ,收集中间的液相层。
剩余的残渣中再加1mL DNA extraction buffer 和1mL SDS bu ffer ,65e 水浴5m in ,8000r #m i n -1离心15m i n ,收集中间液相层。
按上述方法把残渣再抽提1次,收集的液相层与前两次的合并,12000r #m in -1离心5m i n ,收集上清液,用等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24B 1)抽提1次,15000r #m in -1离心20m i n ,收集上清液,并加入011倍体积的3m o l #L -1N a Ac (p H 512),用手颠倒混匀后,加入016倍体积异丙醇,室温沉淀DNA 1h,15000r #m i n -1离心20m i n ,弃上清液。
DNA 沉淀用70%乙醇洗涤1次,冷冻干燥后将粗DNA 溶于500L L 灭菌dd H 2O 中。
在粗DNA 溶液中加入等体积酚,颠倒混匀,15000r #m in -1离心20m i n ,收集上清液;加入等体积氯仿/异戊醇(体积比为24B 1),颠倒混匀,15000r #m i n -1离心20m i n ,收集上清液;加入011倍体积3m ol #L -1Na A c (pH512),颠倒混匀,加入016倍体积异丙醇沉淀DNA 1h ,15000r #m in -1离心20m i n ,弃上清液。
DNA 沉淀用70%乙醇洗涤1次,冷冻干燥后溶于100L L 灭菌dd H 2O 中。
