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植物激素的测定方法植物激素是一类由植物自身合成并参与生长发育调控的活性物质，对植物的生长发育起着重要作用。
因此，准确测定植物激素的含量对于研究植物生长发育调控机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的植物激素测定方法。
一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最广泛的植物激素测定方法之一。
该方法基于植物激素在高效液相色谱柱上的保留时间和峰面积，通过与已知浓度的标准品比较，可以计算出待测样品中植物激素的含量。
高效液相色谱法具有分离效果好、分析速度快、准确度高的优点，但需要专用的仪器设备，操作较为复杂。
二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的植物激素测定方法。
该方法通过将待测样品中的植物激素转化为易挥发的衍生物，然后在气相色谱柱上进行分离和定量分析。
气相色谱法具有测定灵敏度高、分离效果好的特点，但需要对样品进行预处理，并且对仪器的稳定性要求较高。
三、酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学测定方法，也可以用于测定植物激素的含量。
该方法通过将植物激素与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗进行检测，最后通过比色反应或发光反应来测定植物激素的含量。
酶联免疫吸附法具有操作简便、成本较低的优点，但需要特异性较好的抗体。
四、放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法是一种使用放射性同位素标记的植物激素进行测定的方法。
该方法通过将放射性同位素标记的植物激素与待测样品中的植物激素结合，然后通过放射性计数来测定植物激素的含量。
放射免疫测定法具有灵敏度高、测定范围广的特点，但需要使用放射性同位素，存在辐射危险。
五、质谱法（MS）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于测定微量的植物激素。
该方法通过将待测样品中的植物激素通过质谱仪进行分子质量分析，从而测定植物激素的含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，但需要专用的仪器设备和较高的技术水平。
植物激素测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法和质谱法等。
植物激素的检测方法1. 生物测试生物测试法是最早采用的植物激素测定方法它是利用植物激素的生理活性通过某些植物的组织和器官对植物激素产生的特异性反应进行测定的。
优点：简便易行也能反映植物激素的生理活性缺点：专一性较差且植物体内含有生长素类似物~ 拮抗物等影响测定的结果需在前处理中尽可能纯化所要测定的组分过程复杂此外重复性差工作量大2. 免疫检测免疫学技术应用于植物激素的测定有力地促进了激素定量研究的发展它的基本原理是利用抗原和抗体的特异性竞争结合。
优点：了检测灵敏度可检测出10-12 g 的微量物质相应其前处理也得到了简化又改善了测定的专一性。
缺点：抗体的制备较复杂。
3.物理化学方法物理化学方法分光谱法和色谱法两种1）分光谱法：主要有紫外吸收光谱~ 红外吸收光谱和荧光法优点：灵敏度高缺点：专一性差2）色谱法：利用物质在不同介质中的分配原理进行测定的，包括纸上层析，薄层层析(TLC) ，气相色谱(GC) ，高效液相色谱(HPLC) 以及气质联用(GC-MS) 等，将分离和测定结合起来是色谱法的基本特点。
（1）纸上层析和TLC：优点：设备简单易操作缺点：分离效率和灵敏度有限制（2）G C 和HPLC：是在纸上层析和TLC 的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器，保证了检测方法的专一、灵敏和准确（3）GC 和HPLC 方法:分析植物激素, 灵敏度和选择性高, 重复性好, 但对前处理要求较高; 又因保留时间的分辨有一定限制, 若达不到所需纯度要求可能会出现多种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果。
（4）在植物激素的理化检测中, 仪器联用是当代的发展趋势：最常用的结合系统是气相色谱-质谱联用(GCMSD，技术, 它是目前最为可靠的激素检测方法, 还可验证其它测定方法的可靠性, 而且还可鉴定未知物质的结构，但需经冗长的样品纯化程序, 设备昂贵, 使用和维护成本高。
此外有气液相色谱( GLCD 配以火焰热离子检测器(FTDD 快速灵敏地对植物细胞分裂素定量测定[25], 也有薄层色谱与气相色谱结合分析ABA。
植物激素检测技术——科标检测植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程,既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。
通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。
青岛科标检测研究院—-生物实验室，拥有先进的仪器设备和丰富检测经验，根据国内外先进技术，可以根据不同样品不同检测需求，值得最优检测方案为企业和研究机构提供精确、公正的数据支持.1 植物激素主要包括生长素（auxin）、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素（cytokinin,CTK)、脱落酸（abscisic acid，ABA）、油菜素甾醇类（brassinosteroids，BRs）、茉莉酸（jasmonic acid，JA)及其甲酯（MeJA)、水杨酸类(salicylic acids,SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素（peptide hormones)等,它们在植物体内的含量极低（通常在ng/g，甚至pg/g水平上),且周围共存的基体成分非常复杂，几乎不可能同时分析所有植物激素.此外,多数植物激素的性质不稳定，对温度等外界条件敏感，在各器官中呈现定的动态分布。
因此精确可靠地对超微量的植物激素进行定性和定量分析尤为重要.本文仅就近年来国内外在茉莉酸及其甲酯、脱落酸、生长素、赤霉素和多肽激素等植物激素分析检测技术的最新发展及应用情况进行综述。
2 主要分析技术生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法,它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。
1928年，Went首先将这种方法运用于生长素的测定，利用生长素能使燕麦胚芽鞘弯曲的特性来测定生长素浓度。
酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。
二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。
其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。
ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。
间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。
如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。
图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。
实验17 酶联免疫吸附检测法（ELISA）测定植物激素含量一、原理植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一种类型。
在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。
酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体（识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白），称为酶标二抗。
这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。
A.固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体（Mab）与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体（RAMIG）结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与固相化的Mab结合，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记激素（酶标激素）。
通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。
B.固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）包被于固相载体，加入待测激素（样品或标准品）和抗IAA多克隆抗体（Pab）反应，进行竞争反应。
然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体（HRP-GARIG）与结合在固相上的Pab反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：高等植物、真菌、藻类等组织或器官。
（二）仪器设备：1. 酶联免疫检测仪；2. 高速冷冻离心机；3. 恒温箱；4. 连续进样器；5. 涡旋仪；6. 96孔微孔板；7. 离心管；8. 研钵或匀浆器；9. 试管。
（三）试剂1. 洗涤缓冲液：0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG 溶液，或“激素-蛋白”复合物；3. 0.1％封闭蛋白（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素标准品母液，及参比系列溶液（按双倍或四倍系列稀释）；6. HRP标记激素，或HRP-GA RIG；7. 邻苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
(3) 样品稀释液：100 ml PBS中加0.1 ml Tween-20，0.1g明胶（稍加热溶解）。
(4) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，溶解定容至1 000ml，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。
(5) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。
(6) 终止液：2mol/L H2SO4。
（7）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，在配成80%的浓度))。
（8）激素包被抗原、各激素抗体和标准物。
（9）酶标二抗：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔抗体。
操作步骤1．样品中激素的提取（1）称取0.5-1.0g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻后保存在-20℃的低温冰箱中），加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。
（2）4℃下提取4h，1 000g离心15min(实验中离心机型号LDZ5-2，约4 000rpm), 取上清液。
沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。
（3）上清液过C-18固相萃取柱。
具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。
（4）将过柱后的样品转入5ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容（一般1g鲜重用1.5ml左右样品稀释液定容）。
2．样品测定（1）包被：在10ml包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀，在酶标板每小孔中加100μl。
然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37℃下3h。
（2）洗板：将包被好的板取出，放在室温下平衡。
然后甩掉包被液，将下口瓶内的洗涤液通过乳胶管均匀加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5min,再甩掉洗涤液。
重复3次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。
（3）竞争：即加标准物、待测样和抗体。
加标样及待测样：取样品稀释液0.98ml，内加20μl激素的标样试剂（100μg／ml）,即为2000ng/ml标准液，然后再依次稀释1000ng/ml, 500ng/ml,250/ng/ml,125ng/ml…,0ng/ml。
将系列标准样加入96孔酶标板的前三行，每个浓度加3孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复三孔，每孔50μl。
加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签）,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
竞争条件37℃左右0.5h。
（GA4为37℃、17分钟）（4）洗板：方法同包被之后的洗板。
但要注意以下两点：①加洗涤液时一定要从标准曲线的低浓度一边向高浓度一边加，并且酶标板要向高浓度的一边倾斜。
②第一次加入洗涤液后要立即甩掉。
然后再接着加第二次。
注意这两点的目的是防止各孔的交叉反应。
（5）加二抗：将一定量的酶标羊抗兔抗体，加入10ml样品稀释液中（最适稀释倍数见试剂盒标签），混匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
（6）洗板：方法同竞争之后的洗板（步骤4），洗五次，（7）加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完全溶解后加2~4μl 30% H202。
混匀，在每孔中加100μl（在暗处操作），然后放入湿盒内，当显色适当后（即0ng/ml孔与2000ng/ml孔的OD差值为1.0左右时），每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。
（8）比色：用2000ng/ml浓度孔（即标准曲线最高浓度孔）调0，在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。
结果计算与分析用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。
曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。
Logit值的计算方法如下：B/B0 BLogit（B/B0）=ln———— =ln————1-B/B0 B0-B其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色值。
作出的logit曲线在检测范围内应是直线。
待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/ml）。
另外，也可用激素标样各浓度（ng/ml）的自然对数与各浓度显色值的logit值的回归方程代替logit曲线，求得样品激素的浓度。
一般来说，二种方法求得的结果会略有差异。
求得样品中激素的浓度后，样品中激素的含量（ng/g·fw）可用下式计算：N·V2·V3·BA = —————V1·W其中，A表示激素的含量（ng/g·fw）；V2表示提取样品后，上清液的总体积；V1表示进行真空浓缩干燥的上清液体积；（当提取的上清液全部进行真空浓缩干燥时V1与V2的体积是相等的）V3表示真空浓缩后用样品稀释液定容的体积；W表示样品的鲜重；N表示样品中激素的浓度（ng/ml）；B表示样品的稀释倍数（样品稀释液定容以后的稀释倍数）。
注意事项激素提取液中是否存在干扰物质的判断和去除通常用以下几个质量控制试验来判断提取液中是否存在干扰物质：①稀释试验，即将样品提取液做一系列稀释，进行ELISA测定，所获得的剂量反应曲线应与标准曲线平行，或者说测定值与稀释倍数相对应，例如做10倍稀释，则测定值应是原值的1／10，若差异太大，表明有干扰物存在。
②平行试验，即将样品提取液定量加入系列浓度的标准物之中，进行ELISA测定，所得出的标准曲线应与不加样品液的标准曲线平行，否则可以断定有干扰物存在。
③回收率试验，将样品分为完全等量的两份，一份加入已知量的标准激素，另一份做对照，进行提取测定，两个测定值之差与加入值之比即为回收率，若回收率过低或者超过100％，也说明有干扰物存在。
④仪器法校正试验，ELISA 测定的样品量极微，而且样品纯度要求比仪器法要低得多，因而用通常的气谱或液谱法难以对ELISA 作出校正，目前用高分辨率的气质联机可以对ELISA作出校正，目前用高分辨率的气质联机可以对ELISA测定作出适当的评价。
样品中存在的干扰物质有色素、酚类物质等。
酚类物质可用可溶性与不可溶性PVP（聚乙烯吡咯烷酮）除去，可溶性PVP可直接溶于样品提取液中，不溶性PVP可在研磨时加入。
一般材料在加入0-100mgPVP/gFW即可达理想效果。
叶绿素等色素可通过将激素提取液过C18预处理小柱去除。
2 为得到较好效果，操作一定要认真，注意：（1）在整个ELISA操作过程中，每次加样尽可能一致，速度要快。
（2）若同时做二块以上的板，应将洗好的板放在4℃下，依次拿出加样。
（3）加样的环境温度不宜过高。
（4）不使用边缘孔时，每次加样后，也应在边缘孔内加入相应的溶液。
（5）在正式样品测定之前，先通过预备试验找到包被抗原、抗体、二抗的最适稀释倍数及标准物的最佳范围。
（6）抗原、抗体、二抗及标准物保存在－20℃下，随用随拿，并尽量缩短取样时间。
3 关于影响ELISA测定结果的两个问题：①线性检测范围，是指logit标准曲线中的线性测定范围。
在样品测定过程中，应选择合适的稀释倍数，使测定结果落在logit标准曲线的线性范围之内。
②交叉反应，是指抗体与被测定激素以外的物质所起的反应。
在样品测定过程中，要注意与抗体有较高交叉反应的物质，并尽量将其在提取液中排除。
