2012 银杏酮酯对衰老大鼠海马炎症相关细胞因子的调节作用

8. 21 ± 1. 14
注： 与正常组比较1） P ＜ P ＜
0. 05，4） P ＜ 0. 01（ 表 2，3 同） 。
3. 2 GBE50 对衰老模型大鼠海马细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 蛋 白 表 达 的 影 响 各 组 海 马 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达胞浆棕黄色为阳性表达，可以看到 阳性表达呈圆形、梭形或三角形。正常组表达少或 没有表达； 而模型组表达相对多，颜色也深； GBE50 组和 EGB761 组较模型组表达减少（ 图 1，2） 。各组 阳性表达平均吸光度进行统计比较，结果显示： 模型 组与正常组比较，2 种细胞因子平均吸光度都明显 升 高 （ P ＜ 0. 01 ） ； 与 模 型 组 比 较，GBE50 组 和 EGB761 组 IL-1β 的 平 均 吸 光 度 明 显 降 低 （ P ＜ 0. 01） ，GBE50 和 EGB761 组 TNF-α 的平均吸光度 也显著降低（ P ＜ 0. 01） （ 表 2） 。
表 1 各组大鼠海马细胞因子 IL-1β，TNF-α mRNA 的表达 （ x珋± s，n = 6） Table 1 The mRNA expression levels of IL-1β and TNF-α in rat's hippocampus of different groups（ x珋± s，n = 6）
第 37 卷第 14 期 2012 年 7 月
Vol. 37，Issue 14 July，2012
银杏酮酯对衰老大鼠海马炎症相关 细胞因子的调节作用
贺改英，徐颖，吴丽莉，张志雄*
（ 上海中医药大学 生理教研室，上海 201203）
［摘要］ 目的： 研究银杏酮酯（ Ginkgo biloba extract 50，GBE50） 对衰老模型大鼠海马促炎症细胞因子白介素-1β（ interleukin-1 beta，IL-1β） 、肿瘤坏死因子-α（ tumor necrosis factor-alpha，TNF-α） 和抗炎症细胞因子白介素-4 （ interleukin-4，IL-4） 、白介 素-10（ interleukin-10，IL-10） 的调节作用，探索 GBE50 对衰老动物中枢神经系统的保护机制。方法： SD 大鼠随机分为 4 组： 正 常组、模型组、GBE50 组和 EGB761 组，采用 D-半乳糖 100 mg·kg －1 每日腹腔注射建立衰老大鼠模型，持续 42 d，GBE50 组和 EGB761 组分别在造模第 21 天开始给予 60 mg·kg －1 剂量灌胃，共 21 d。采用实时荧光定量 PCR 检测海马细胞因子 IL-1β mRNA 和 TNF-α mRNA 表达，免疫组织化学法检测海马细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达，酶联免疫吸附试验测定海马细胞 因子 IL-4 和 IL-10 蛋白含量。结果： D-半乳糖可造成衰老模型大鼠海马促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子的失调，GBE50 和 EGB761 降低了海马 IL-1β mRNA 表达（ P ＜ 0. 05） ，减少了 TNF-α 和 IL-1β 的蛋白表达水平（ P ＜ 0. 01） ，上调了 IL-10 蛋白含量 （ P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05） 。结论： GBE50 保护中枢神经系统的作用机制可能与 GBE50 改善中枢神经系统炎症有关。
表 2 各组大鼠海马细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 的蛋白表达 （ x珋± s，n = 8） Table 2 The protein expression levels of IL-1β and TNF-α in rat's hippocampus of different groups（ x珋± s，n = 8）
组别
正常 模型 GBE50 EGB761
剂量 / mg·kg － 1 － － 60 60
IL-1β
0. 19 ± 0. 01 0. 32 ± 0. 022） 0. 23 ± 0. 014） 0. 24 ± 0. 014）
［关键词］ 衰老； 银杏酮酯； 促炎症细胞因子； 抗炎症细胞因子
随着社会老龄化的日益加剧，抗衰老已是一个 社会关 注 的 问 题。在 衰 老 过 程 中，中 枢 神 经 系 统 （ central nervous system，CNS） 的免疫功能出现紊乱， 越来越多的证据表明在衰老过程中，神经炎症起了 极其重要的作用，研究发现炎症可以加速衰老，引起 长期的行为和认知缺陷，造成神经元的损伤等［1-3］。 本实验通过检测大鼠海马细胞因子白介素-1β （ interleukin-1 beta，IL-1β） 、肿瘤坏死因子-α（ tumor necrosis factor-alpha，TNF-α ） 、白 介 素-4 （ interleukin-4， IL-4） 和白介素-10 （ interleukin-10，IL-10） ，来研究银 杏酮酯（ Ginkgo biloba extract 50，GBE50） 对衰老大 鼠促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子的调节作用， 探讨衰老动物脑内的炎症反应机制以及 GBE50 对 衰老动物 CNS 的保护机制。 1 材料 1. 1 动物 清洁级 SD 大鼠，雄性，体重 150 ～ 180
［稿件编号］ 20111215007 ［基 金 项 目］ 上 海 市 科 学 技 术 委 员 会 科 研 计 划 项 目 （ 09ZR1432100） ； 上海市教育委员会重点学科项目（ J50301） ［通 信 作 者］ * 张 志 雄，Tel： （ 021 ） 51322588，E-mail： zixion @ online. sh. cn ［作者简介］ 贺 改 英，博 士 研 究 生，主 要 从 事 中 药 抗 衰 老 研 究， E-mail： gaiyinghe2012@ 163． com
20% 乌拉坦 （ 5 mg · kg － 1 ，ip） 麻醉大鼠，断头取 脑，小心剥离出脑组织，分离海马，将海马组织转移 到玻璃试管中，依次加入 1 mL Trizol，电动匀浆器以 8 000 r·min － 1 处理 30 ～ 45 s。提取样品总 RNA，测 定 RNA 浓度和纯度，总 RNA 逆转录成 cDNA。每个 样本中加入 GAPDH 和 IL-1β 或 TNF-α 引物，同时进 行 PCR 扩增，PCR 反应条件： 95 ℃ 预变性 5 min； 95 ℃ 变性 15 s，55 ℃ 退火 32 s，72 ℃ 延伸 32 s，重复 40 个循环； 72 ℃ 延伸 5 min。引物序列： TNF-α F 5'TGACTTTCTCCTGGTATGAAATGG-3'，R 5'-TGACTT TCTCCTGGTATGAAATGG-3'； IL-β F 5'-GACCCAAG CACCTTCTTTTCC-3'，R 5'-CACACTAGCAGGTCGTCATCATC-3'； GAPDH F 5'-CCGAGGGCCCACTAA AGG-3'； R 5'-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3'。 采用仪器自带软件 ABI Prism 7500 SDS Software 分 析数据。 2. 3 海马细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表达测定
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g，由上海中医药大学实验动物中心提供，合格证号 SCXK（ 沪） 2003-0002。饲养于 12 h 光照 /12 h 黑暗 的环境中，自由摄食和饮水。 1. 2 仪 器 及 试 剂 Wellscan MK2 酶 标 仪 （ 芬 兰 Labsystems ） ； Wellwash4 洗 液 装 置 （ 芬 兰 Labsystems） ； DL-50RC 冷冻离心机（ 上海中科生物医学 高科技开发有限公司） ； ABI-7500 Real-time 检测仪 （ 美 国 ABI） ； BX51 系 统 显 微 镜 （ 日 本 Olympus） ； RM2126PT 轮转式切片机（ 德国 Leica） 。D-半乳糖 （ 上 海 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司，批 号 F20061025） ； 银杏酮酯（ 上海杏灵科技药业有限公 司惠赠，批号 071008） ； 银杏叶提取物 761（ EGB761， 上海杏灵科技药业有限公司惠赠，批号 070802） ； 大 鼠 IL-4，IL-10 ELISA 试剂盒（ 美国 R＆D 分装） ； 兔抗 大鼠 IL-1β 一抗（ R＆D systems，批号 YR056101） ； 兔 抗 TNF-α 多克隆一抗（ 博士德生物工程有限公司， 批号 200810） 。 2 方法 2. 1 造模 SD 大鼠随机分为 4 组： 正常组、模型 组、GBE50 组和 EGB761 组，正常组 15 只，其他组各 16 只。按 100 mg·kg － 1 D-半乳糖给予大鼠腹腔注 射建立衰老模型，正常组每天注射等量生理盐水，持 续 42 d，从实验第 21 天开始分别给予 60 mg·kg － 1
第 37 卷第 14 期 2012 年 7 月
Vol. 37，Issue 14 July，2012
以 1% CMC-Na 溶液溶解的 GBE50 和 EGB761 灌胃， 正常组给予等量 1% CMC-Na 溶液灌胃，持续 21 d。 2. 2 海马细胞因子 IL-1β，TNF-α mRNA 表达测定
因素方差分析，数据采用 x珋± s 表示。 3 结果 3. 1 GBE50 对衰老模型大鼠海马细胞因子 IL-1β， TNF-α mRNA 表达的影响 模型组 IL-1β 和 TNF-α 2 种细胞因子 mRNA 与正常组相比表达量均上升 （ P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05） ，GBE50 组和 EGB761 组 IL-1β mRNA 的表达量与模型组相比都下降 （ P ＜ 0. 05） ； 而 2 组 TNF-α mRNA 表达量与模型组相比，也表现 出下降的趋势（ 表 1） 。
组别 剂量 / mg·kg － 1 IL-1β mRNA