下载文档原格式
液相色谱串联质谱内标法测定猪肉中沙丁胺醇的不确定度分析杨 翠（甘孜州食品药品检验所，四川甘孜 626000）摘 要：目的：通过液相色谱串联质谱内标法测定猪肉中沙丁胺醇的含量，探究检验过程中的影响因素，并计算各因素的不确定度，为准确测定沙丁胺醇含量提供科学指导。
方法：按照《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL06：2019）、《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）和《食品安全国家标准动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.22—2022），分析不确定度来源。
结果：样品测定值为28.3 μg·kg-1，取置信区间为95%，扩展不确定度为4.477 μg·kg-1（k=2）。
结论：通过对仪器设备、样品制备、标准品及内标、样品重复性测定和温度等因素的评估计算，结果发现高效液相色谱仪串联质谱仪、标准曲线配制、内标物质纯度对检测结果的影响较大，在实际测量过程中，严格控制实验条件可提高检测的可靠性、准确性。
关键词：液相色谱串联质谱法；不确定度；猪肉；检测；沙丁胺醇Uncertainty Analysis of Salbutamol in Pork by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry with InternalStandard MethodYANG Cui(Ganzi Institute of Food and Drug Inspection, Ganzi 626000, China)Abstract: Objective: To determine the content of salbutamol in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry internal standard, explore the influencing factors in the testing process, and calculate the uncertainty of each factor, in order to provide scientific guidance for the accurate determination of salbutamol content. Method: Sources of uncertainty were analyzed according to CNAS—GL06:2019, JJF 1059.1—2012 and GB 31658.22—2022. Result: The sample was measured at 28.3 μg·kg-1, the confidence interval was 95%, and the extended uncertainty was 4.477 μg·kg-1(k=2). Conclusion: Through the evaluation and calculation of factors such as instrument equipment, sample preparation, standard and internal standards, sample repeatability determination, and temperature, it was found that high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, standard curve preparation, and internal standard substance purity have a significant impact on the detection results. In the actual measurement process, strict control of experimental conditions can improve the reliability and accuracy of detection.Keywords: liquid chromatography tandem mass spectrometry; uncertainty; pork; detection; salbutamol沙丁胺醇（Salbutamol）属于一种具有选择性的β受体激动剂，能进行性激动支气管平滑肌的β受体的选择，扩张支气管[1-3]。
基于液相色谱串联高分辨质谱的动物源农产品兽药残留检测研究综述一、引言动物源农产品中兽药残留一直是食品安全领域的重要问题之一。
因为不当使用兽药或者药物残留物在动物体内积累，消费者可能会通过饮食摄入带有兽药残留的农产品，从而对人体健康造成危害。
为了保障兽药使用的安全性和兽药残留的合规性，各国纷纷加强了对动物源农产品中兽药残留的监管和检测要求。
传统的兽药残留检测方法主要包括高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、液相色谱串联质谱（LC-MS）等方法。
这些传统方法在检测灵敏度、准确度、稳定性等方面存在着一定的局限性。
液相色谱串联高分辨质谱（LC-MS/MS）技术的出现，为兽药残留的检测提供了更高效、更精准和更可靠的技术手段。
本文将综述近年来液相色谱串联高分辨质谱在动物源农产品兽药残留检测研究中的应用情况和发展趋势。
二、液相色谱串联高分辨质谱原理及特点液相色谱串联高分辨质谱（LC-MS/MS）是将液相色谱（LC）和质谱（MS）相结合的一种分析技术，其具有以下几个主要特点：1.高效：LC-MS/MS技术能够对样品中的化合物进行高效的分离和分析，具有较高的测定灵敏度和分辨率。
5.可靠：LC-MS/MS技术的分析结果可靠性高，操作简便，适用于复杂样品的分析和检测。
以上特点使得LC-MS/MS技术成为动物源农产品兽药残留检测的理想选择。
三、液相色谱串联高分辨质谱在兽药残留检测中的应用近年来，液相色谱串联高分辨质谱在动物源农产品中兽药残留检测方面得到了广泛的应用，尤其是在禽畜肉类、鱼类、牛奶和蜂蜜等产品的兽药残留检测研究中取得了显著的进展。
1.禽畜肉类兽药残留检测许多研究表明，液相色谱串联高分辨质谱技术可用于对禽畜肉类产品中的兽药残留进行快速、准确的检测。
针对瘦肉精、氯霉素、磺胺类药物等兽药残留的检测研究表明，LC-MS/MS技术能够对禽畜肉类产品中的多种兽药残留进行高效分析，具有灵敏度高、检测速度快的优势。
四、发展趋势及挑战尽管液相色谱串联高分辨质谱技术在动物源农产品兽药残留检测中具有诸多优势和应用前景，但是也面临着一些挑战。
液相色谱-串联质谱法测定食品接触材料中5种乙醇胺类化合物的迁移量李慧勇;王海洋;熊小婷;谭建华;廖惠媚;赖红霞;黄日林;李燕飞;陈意光【摘要】建立了不同食品接触材料中5种乙醇胺类化合物迁移量的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定方法.以5种不同食品模拟物(水、4％乙酸、10％乙醇、50％乙醇、95％乙醇)浸泡样品,4％乙酸浸泡液经氮气吹干后用水复溶,其他浸泡液直接过滤后进样.采用氨基柱BEH Amide(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)分离,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液为流动相,梯度洗脱分离,在电喷雾源的正离子多反应监测(MRM)模式下检测,外标法定量.在优化条件下,5种乙醇胺类化合物在1.0～ 750.0 μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.997,检出限(LOD,S/N=3)和定量下限(LOQ,S/N=10)分别为0.3～5.0 μg/kg和1.0～15.0μg/kg.在1.0～750.0 μg/kg加标水平下的回收率为90.2％～ 118％,相对标准偏差(RSD)为0.5％～8.8％.该方法高效灵敏、准确可靠,可满足相关检测的需求.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2018(037)008【总页数】5页(P930-934)【关键词】食品接触材料;乙醇胺类化合物;液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS);迁移量【作者】李慧勇;王海洋;熊小婷;谭建华;廖惠媚;赖红霞;黄日林;李燕飞;陈意光【作者单位】广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447;广州质量监督检测研究院国家包装产品质量监督检验中心(广州),广东广州511447【正文语种】中文【中图分类】O657.63;O623.731乙醇胺类化合物是一类重要的化工产品，其中乙醇胺(Monoethanolamine，MEA)、二乙醇胺(Diethanolamine，DEA)和三乙醇胺(Triethanolamine，TEA)总称为乙醇胺，是氨基醇中最有实用价值的产品，占氨基醇总量的90%～95%[1]。
第6期收稿日期：2013－04－15作者简介：董文婷（1985-），女，湖北武汉人，初级药师，主要从事兽药残留检测工作。
苯乙醇胺A ，又称作克伦巴胺。
它是福莫特罗的同分异构体，是在合成莱克多巴胺时产生的副产物，具有和莱克多巴胺相同的作用和效果，属于β-激动剂的一种。
苯乙醇胺A 作为β-激动剂，将其添加到饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料的使用、节约成本，是一种新型违禁药物。
苯乙醇胺A ，分子式为C19H24N2O4，化学式为2-［4-(4-硝基苯基)丁基-2-羟基氨基］-1-（4-为甲氧基苯基）乙醇，化学结构式2-(4-(nit-rophenyl )butan -2-ylamino )-1-(4-methox yphenyl)ethanol 。
其结构式见图1。
莱克多巴胺的结构式见图2。
通常实验室β-激动剂的确证方法有:LC-MS-MS 法和GC-MS 法［1］，农业采用有LC-MS 法检测动物尿液中β-激动剂［2］，上海饲料中心近年来发布了饲料中苯乙醇胺A 的液相色谱-质谱检测方法［3］。
本文采用酶解方法，经前处理后干扰杂质少，再通过超高效液相色谱－串联质谱测定猪尿中苯乙醇胺A ，该方法用同位素内标法定量结果准确可靠，适用于作苯乙醇胺A 的残留确证分析。
1材料与方法1.1仪器与设备超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC Quattro Premier)，美国Waters 公司；AE260电子天平，Mettler-toledo 公司；HimacCF16RX 高速冷冻机，HITACHI 公司；SIR4漩涡振荡器，IKA 公司；Toledo 320酸度计，Mettler -toledo 公司；PIERCE IL61105样品浓缩器；MCX 固相萃取柱，60mg/3mL ，美国Waters 公司；0.22μm 微孔滤头。
1.2药品、试剂与材料苯乙醇胺A ，纯度96.0%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；同位素内标莱克多巴胺（Ractopamine -d3）购自Dr1Ehrenstorfer 公司；甲醇、甲酸为色谱纯;氢氧化钠、氨水、乙酸乙酯为分析纯；水为超纯水，美国MILLIPORE 超纯水仪自制；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(β-Glucuro-nidase/aryl sulfatase)。
1.3标准溶液储备液的制备(100μg/mL)准确称取苯乙醇胺A 标准品约10mg 至100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即含苯乙醇胺A 100μg/mL ，于-20℃保存。
标准工作液A 的制备(100ng/mL)：精密量取0.10mL 储备液至100mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，液相色谱—串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺Ａ董文婷，朱曦，梁利妹，万珊（湖北省兽药监察所，武汉430070）摘要：建立了一种超高效液相色谱—串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A 的方法。
猪尿样品以莱克多巴胺—D 3为内标，尿液经酶解提取后经MCX 固相萃取柱净化，超高效液相色谱—串联质谱法测定。
苯乙醇胺A 监测离子为m/z 344.7>149.5和m/z 344.7>326.7。
结果表明在1~100ng/mL 范围内苯乙醇胺A 呈良好的线性关系，高中低浓度相对回收率在98.8%~118.0%，变异系数小于10%，定量限为0.2ng/mL 。
该方法用同位素内标法定量准确，适用于猪尿中苯乙醇胺A 的残留测定。
关键词：猪尿；苯乙醇胺A ；超高效液相色谱-串联质谱法；同位素内标法中图分类号：S851.34文献标识码：B文章编号：1007－273X （2013）06-0009-0234505月05May 图2莱克多巴胺结构式第卷第6期2013年06湖北畜牧兽医Hubei Journal of Animal and Veterinary SciencesVol．34No ．06June 2013图1苯乙醇胺A 结构式（下转第28页）添加浓度//ng/mL 0.50.50.52.02.02.010.010.010.0平均回收率//%114.0106.0110.098.8105.0110.0102.0118.0106.0RSD （批内）//%3.96.47.24.93.45.35.95.12.8RSD （批间）//%6.56.37.8表1回收率及相对标准偏差（n =5）摇匀，即得100ng/mL 的标准工作液，4℃保存备用。
标准工作液B 的制备(10ng/mL)：精密量取5.0mL 标准工作液A 至50mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得10ng/mL 的标准工作液，4℃保存备用。
同位素内标储备液的制备（100μg/mL)：称取10mg 的莱克多巴胺同位素内标置于100mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，于-20℃条件下保存。
同位素内标工作液的制备(100ng/mL)：精密量取0.10mL 储备液至100mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得100ng/mL 的标准工作液，4℃保存备用。
1.4仪器条件1.4.1色谱条件色谱柱为Waters ACQUITYUPLC BEHC18柱(50mm ×2.1mm ，粒径1.7μm)；柱温：30℃；进样体积为5μL ；流动相A ：0.1%甲酸甲醇溶液，流动相B ：0.1%甲酸水溶液；流速0.2mL/min ；线性流动相梯度洗脱条件：0min ，B ：80%；0～1min ，B:80%～20%；1～3min ，B ：20%～80%；线性变换。
1.4.2质谱条件离子源:电喷雾电离(ESI+)；扫描方式：正离子扫描;检测方式：MRM(多反应监测)；毛细管电压:3.2kV ，锥孔电压:25V;离子源温度:110℃;雾化气温度:350℃;雾化气流量:650L/h;锥孔气流速：50L/h ；光电倍增器：650V 。
1.4.3样品前处理（1）酶解。
准确量取样品5mL 于50mL 离心管中，加入2mol/L 乙酸铵溶液(pH5.2)0.5mL ，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL ，涡旋混匀，于37℃下避光水浴振荡16h 。
（2）提取。
酶解后放置至室温，添加100ng/mL 的同位素内标工作液100μL 于待测样中，涡旋混匀，10000r/min 离心10min ，转移上清液于另一50mL 离心管内。
用10mol/L NaOH 溶液调节pH 至9.8±0.2，加入10mL 乙酸乙酯，再加入1.5g 氯化钠固体饱和水相，涡旋混匀后振荡10min ，5000r/min 离心5min ，吸取上层有机溶剂于离心管中，再加入10mL 乙酸乙酯，同前操作，合并提取液；氮气吹干（50℃）。
用5mL 2mol/L 的乙酸铵溶液（pH5.2）溶解残余物，备用。
（3）净化。
MCX 固相萃取柱依次用甲醇、水、0.2%甲酸各3mL 活化，然后将备用液过柱；依次用水、0.2%甲酸、甲醇各3mL 淋洗，减压抽干MCX 小柱；再用5%氨化甲醇5mL 洗脱，收集洗脱液，50℃下氮气吹干，用0.5mL 甲醇-0.1%甲酸/水（5+95,V /V ）溶液溶解，经0.22μm 滤膜过滤后进行测定。
2结果与分析（1）苯乙醇胺A 标准品和加标样品特征离子在上述仪器条件下，保留时间为1.85min 。
结果表明，在相应的保留时间内，空白组织对被测物无任何干扰。
（2）标准曲线绘制。
分别取适量苯乙醇胺A 标准工作液，制得1、2、5、10、20、50、100ng/mL 7个浓度点的对照溶液（内标均为20ng/mL ）。
以苯乙醇胺A 和内标物的浓度比为横坐标，二者定量离子峰面积比值为纵坐标，得到苯乙醇胺A 的标准曲线。
苯乙醇胺A 在1～100ng/mL 浓度范围内呈现良好线性关系，线性方程为y ＝33.834x +6.0207，r =0.9965。
（3）灵敏度的确定。
将苯乙醇胺A 标准工作液分别添加到3份空白猪尿中，制成浓度为0.1、0.2、0.5ng/mL 的添加样品，经1.4.3方法处理后，用超高效液相色谱－串联质谱检测，计算特征离子信噪比（S/N ），当浓度为0.2ng/mL （S/N 大于10）为方法定量限，浓度为0.1ng/mL （S/N 大于3）为方法检测限。
（4）准确度和精密度的确定。
采用标准添加法，在空白猪尿中添加0.5ng/mL 、2.0ng/mL 、10.0ng/mL 3个不同浓度药物（内标浓度均为2.0ng/mL ）进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差。
由表1可知，该方法平均回收率为98.8％～118.0％，批内RSD <10％，批间RSD <10％。
3讨论3.1质谱条件的优化采用100ng/mL 的苯乙醇胺A 标准溶液以流动注射的方式以多反应监测正离子模式优化质谱参数，在正离子模式下，化合物全扫描的分子离子［M+H ］最理想。
选择目标母离子，对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、雾化气温度、离子能量等条件进行了优化。
确定质谱参数后，进行子离子扫描并优化各子离子的碰撞能量。
每个物质选择两个子离子，其中响应值较高的子离子作为定量离子，另一个作为辅助定性离子。
期分娩的母猴按8只/间重新放进猴舍饲养。
（4）对相关数据进行登记和汇总。
相关数据有母猴流产数、仔猴出生数等，根据相关数据计算母猴的流产率。
2结果与分析由表2可见，2009年A 、B 繁殖区的母猴流产数据基本持平，2010及2011年经过产后护理的B 区繁殖母猴流产率明显低于未经产后护理的A 区，分别低1.27和2.51个百分点，表明产后护理与否对繁殖母猴的流产率有明显影响。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第10页）3.2酶解条件的选择对于苯酚类型药物，在生物体内主要以葡萄糖醛酸轭合物的形式存在［4］，所以残留分析中通常需要酶解步骤，使分子游离出来。
本研究先通过β-盐酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶进行酶解，再进行提取、净化和测定。
3.3内标的选择稳定同位素内标法定量是保证液质联用分析结果准确的有效途径，以阴性空白猪尿为基质，比较了内标物质与苯乙醇胺A 的相对回收率。
苯乙醇胺A 的绝对回收率为54.2%～75.7%，莱克多巴胺-D3的绝对回收率为48.2%～64.5%，因此选择莱克多巴胺-D3为内标，采用内标法计算该物质的相对回收率在98.8%～118.0%。
4结论采用LC/MS 方法分析猪尿中的苯乙醇胺A ，前处理净化效果好，仪器灵敏度、精确度和线性范围均能达到残留检测的要求，且现阶段LC/MS 仪应用较为普遍，能够满足多批次、大范围监测的目的。
参考文献：［1］李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析［M ］.上海:上海科学技术出版社,2002.［2］ICS67.120B45.农业部1025号公告－11－2008猪尿中β受体激动剂多残留检测液相色谱-串联质谱法［S ］.［3］ICS65.120B46.农业部1486号公告-1-2010饲料中苯乙醇胺A 的测定高效液相色谱-串联质谱法［S ］.［4］朱馨乐,刘琪,孙雷,等.气相色谱－质谱法测定猪尿中莱克多巴胺的研究［J ］.中国兽药杂志,2008(6):36-39.流产数//只1121093流产率//%3.603.760.16流产数//只1358946流产率//%4.343.071.27流产数//只1678384流产率//%5.372.862.51A 区B 区比较（B-A ）组别2009年2010年2011年表22009-2011年A 、B 区母猴流产情况3小结与讨论（1）经过产后护理的繁殖母猴可以明显降低流产率。
