植物显微技术课程教案2004

植物显微技术课程教案学时学分：48学时，2.5学分课程性质：D2，专业选修课班级：2002.10-12，生物技术2000，44人（选课），两个实验班2003.10-12，生物技术2001，51人（选课），两个实验班2004.8-10，生物技术2002，43人（选课），两个实验班课程内容：讲解植物显微技术的原理和方法，并最终使学生掌握植物石蜡制片的方法及其各个环节的原理和技术要点课程安排：上课约5次，10个学时，学习植物显微技术的基本原理。

其余时间分为9次实验，系统学习植物石蜡制片技术，在实验中熟悉、巩固和扩展植物制片的基本理论和技能。

所以本课程是以实验为主的课程。

实验分组：实验中每两个同学组成为一个实验小组。

每个实验小组从取材料开始，完成石蜡制片的全过程。

各个实验小组所用的实验材料互不相同。

实验中有些环节需要几个实验小组的同学相互配合，形成实验大组。

如脱水、透明、浸蜡、包埋等环节是全天连续而不能间断的过程，需要几个实验小组的同学轮流替换，才能完成。

实验要求：要求每个小组独立制作的、合格的石蜡制片不少于20片。

以小组为单位认真写出实验报告。

成绩评定：学生成绩由三个部分构成（1）上课及参加实验的考勤（占30％）（2）合格制片的数量及质量（占50％）（3）试验报告写作的认真程度，及其对实验过程中问题分析的情况（占20％）参考教材：生物学显微技术. 余炳生张仪北京农业大学出版社，1989植物组织制片学. 李正理. 北京大学出版社，1996生物显微技术. 郑国昌人民教育出版社，1978讲课内容和学时安排：实验内容和学时安排：目录第一章概论 (4)一、生物制片的目的 (4)二、生物制片的类型 (4)第二章石蜡制片 (8)第一节石蜡切片的应用范围 (8)第二节石蜡切片的步骤和原理 (8)一、选材 (8)二、杀死、固定和保存 (8)三、冲洗与脱水 (12)四、透明 (13)五、浸透（透蜡）和包埋 (14)六、切片 (16)七、展片和粘片（贴片） (17)八、染色 (18)九、封固（封片） (21)第三章显微镜 (22)第一节显微镜的种类 (22)第二节（复式）显微镜的主要结构 (22)一、物镜 (22)二、目镜 (25)第三节各类研究用显微镜 (25)附件1 植物学实验室工作的注意事项 (27)附件2 石蜡制片流程及要点 (28)附件3 植物制片的时间安排 (36)附表4 植物切片实验记录 (34)附件5 植物显微技术实验报告的基本内容 (35)第一章概论一、生物制片的目的把想要观察的材料制作成适合于在显微镜下观察的薄片，以显示其组织和细胞的结构。

二、生物制片的类型（一）临时制片：1.活体制片法（一种临时制片）将生物个体或一部分置于载玻片上，加水和盖玻片进行观察。

优点：简单、省时，能进行活体观察；缺点：常因组织过厚光线不易透过，活体材料多为无色，未染色，观察效果差，不易长期保存。

（二）永久制片：1.切片法用锋利的刀片将材料切成薄片，便于在显微镜下观察。

为了能够切出薄而且完整的切片，对幼嫩的材料（如，幼嫩的根尖、茎尖、叶片等）必须进行包埋，对坚硬的材料（如木材、竹材）必须进行软化而不用包埋。

本法在生物制片技术中最为重要。

分为：（1）徒手切片法（2）石蜡切片法（3）火棉胶切片法由于过程复杂，已经较少应用。

用滑动切片机切片。

适用于一些质地十分坚硬，脆而且易折或过软的材料，效果较好。

火棉胶是一种硝化纤维素，易燃烧。

火棉胶可以购买（火棉胶片或火棉胶乙醚或纯酒精液），也可以自制。

自制火棉胶：见照相的底片除去药膜，溶于等量的乙醚或纯酒精中，配制成不同浓度的火棉胶液。

制片原理：材料经过固定、脱水，火棉胶液浸泡，火棉胶包埋，滑动切片机切片，脱胶，染色，脱水，透明封片。

（4）冰冻切片法特别适用于水分多，柔软，而且容易收缩的材料，如动物组织，用滑动切片机或旋转切片机，配上制冷装置。

（5）木材切片法（滑走切片法、软化切片法）（生物学显微技术. 余炳生：58）适用于坚硬的木材、竹材、骨质的切片。

材料需要软化，常用的软化剂和软化法有：●甘油酒精法：纯甘油1份＋50％酒精1份，浸泡●氢氟酸法：用10－30％的氢氟酸水溶液浸泡材料，能分解材料中的矿物质（如竹材表皮的硅质）。

之后用水清洗几个小时后，再用甘油酒精液浸泡。

●醋酸纤维素法：适用于极坚硬的木材（如栎类、榉木）材料浸入酒精中1－2天移入纯丙酮中约2小时，除去酒精移入12％移入醋酸纤维素丙酮液，不加热或加热到40度软化后的材料，可以丙酮液中溶去醋酸纤维素。

●石炭酸软化法材料用95％酒精饱和石炭酸液浸泡，60度水浴加热●冰醋酸、双氧水（1：2）法溶液量要超过材料的20倍以上，水浴加热2.非切片法（不用刀）（1）离析法利用化学药剂，如烙酸、硝酸等的作用，将细胞之间的连接部分，即胞间层的物质（果胶质等）分解，使细胞彼此分离，获得单个完整的细胞，用于观察不同组织中细胞的形态。

离析液种类很多，最常用的有：●烙酸-硝酸离析液配方：10％烙酸1份：10％硝酸1份浸泡24－48小时，可以放入35度温箱中●硝酸-氯化钾离析液配方：50%硝酸液＋氯化钾若干水浴加热●盐酸－草酸氨离析液性能缓和，适用于草本植物的髓、薄壁细胞、叶肉等。

70％酒精3份＋浓盐酸1份，浸泡约24小时；水洗干净，再移至0.5％的草酸氨水溶液中几天，每隔1－2天检查，直至材料分离。

●氨水离析法适用于观察分生组织●氯化钾（0.01M）或氯化镁（0.01M）离析法都适用于根尖细胞分离，浸泡12－24小时即可。

原理：材料在不含钙的溶液中，因细胞失去可溶性类脂而分离。

如此分离后的根尖细胞可以进行细胞培养。

●氢氧化钾离析法用1％的氢氧化钾水溶液煮叶片或幼茎直至透明，可以将表皮、表皮毛和气孔与叶肉或皮层薄壁细胞分离，可以制作叶脉标本。

（2）涂片法适用于单细胞、小型的群体藻类，组织疏松或易于分离的植物组织，如花粉囊中的花粉母细胞，根瘤组织等。

将生物组织的少许置于载玻片上，涂成薄层后再经不同处理而作成制片，或再用另一片载玻片盖在上面用力压碎。

根尖涂片法——观察染色体材料预处理，盐酸水解解离、软化，涂片，加盖玻片，染色花药涂片法花药的两端切去，再切成小段，(将花粉母细胞挤出于载玻片上)，涂片染色（媒染、对染）、透明、封片血液细胞的观察（3）压片法将生物组织的一部分置于载玻片上，并隔着盖玻片将其压散开来，而作成制片。

主要用于染色体观察。

与染色体涂抹法的区别是先把材料固定、软化和染色，再进行压片。

（4）整体封固法将细小或扁平的材料经过染色等处理后，把整个材料用封固剂封起来作成制片。

如苔藓植物的叶（5）透明法用化学药剂处理，使组织变得透明而作成制片，如显示维管束。

乳酸－石炭酸透明法乳酸－石炭酸液配制：石炭酸（结晶）10g，蒸馏水、乳酸、甘油各10毫升混合适用于小的材料的透明观察：材料放于载玻片上，加一滴乳酸－石炭酸液，在酒精灯上来回移动加热，冷却后材料变为透明，再整体封片。

氢氧化钠法氢氧化钠液配制：2－10％氢氧化钠水溶液（通常为5％），或者2－10％氢氧化钠水溶液＋50％酒精溶液的量大于材料体积的30－50倍。

材料放于氢氧化钠溶液中24小时左右，细胞内的物资被溶解，所以材料变的透明。

第二章石蜡制片第一节石蜡切片的应用范围制片的方法虽然很多，但是其基本点就是要求尽量保持原来的结构，切成适当的厚度，应用各种染色方法使内部各种结构清晰易见，使材料保持长久，不变形、不腿色。

石蜡制片的优点是一般的材料都适用、切片薄。

能切成连续的蜡带，可以观察到细胞和组织结构的连续变化过程，这是其他方法所不及的。

缺点是制片过程复杂，不适合制作比较坚硬的材料，如木材切片、竹材切片等等。

第二节石蜡切片的步骤和原理石蜡切片包括①选材、②杀死、固定和保存、③冲洗和脱水、④透明、⑤浸蜡和包埋、⑥切片、⑦粘片、⑧染色、⑨封固（封片）等9个步骤。

下面依次介绍。

一、选材根据所要观察的对象和目的，进行选材。

通常选材时要考虑到以下内容：①种类：②部位：③年龄或发育阶段④今后是观察横切面还是纵切面？在上述几点确定之后，取材时一般的要求是新鲜、健康、正常、有代表性，大小不超过1-2厘米，在能满足观察的前提下越小越好，以便能使固定液迅速进入组织、杀死细胞和便于切片。

最好先通过徒手切片在显微镜下观察，以确定材料是否可用。

切割材料时，刀要锋利，用力要均匀，避免组织破裂，影响制片效果。

二、杀死、固定和保存（一）（杀死和）固定将观察材料尽快置于特定的药剂（固定剂）中，将其细胞迅速杀死，并使它尽量保持生活时的自然状态（固定），而不至于在细胞死亡之前材料的形态和结构发生变化，如，结构发生萎缩或分解。

这一过程称为杀死和固定，要求是越快越好。

固定时要注意的事项：（1）固定液的用量要达到材料体积的20-50倍，否则，材料中的水分稀释固定剂的浓度，降低固定效果。

（2）固定时要对材料进行真空抽气。

组织、细胞中都有空气，会阻止固定剂渗透到组织中，使固定不全面和不彻底，影响后续的浸蜡、切片等等。

抽气最好用抽气泵抽气，简易的可以用针筒抽气，或用自来水抽气装置抽气。

（二）保存材料经过固定后，需要保存下来以备利用，这一过程中，要求材料的结构不会发生变化。

有些杀死剂和固定剂本身就是良好的保存剂，有些则不然。

通常使用的保存剂是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。

保存时，通常还要求在冰箱中存放。

（三）好的固定剂的特点1.渗透力强；迅速杀死原生质，并显示出其原来的细微结构；2.增加细胞结构及内含物的折光程度，使各部结构更为清晰，有利于显微镜观察；3.使组织适当地变硬，并具有一定的坚韧性，便于切片。

但又不能过于坚硬或变为松脆，反而不利于切片；4.促进生物组织对某些染色剂的媒染作用，能使组织增加染色能力；5.使组织或细胞不发生收缩和膨胀；6.有良好的保存作用，使材料固定后能经久不坏；（五）混合固定剂实际使用中几乎都是用混合固定剂，使单一固定剂的缺点得到弥补，如能使细胞收缩的试剂要与能使细胞膨胀的试剂配合使用等等。

强氧化剂与强还原剂也不能同时配制在一起，如果需要混合使用，也要分开配制，用时再混合。

１.产生酸性固定相的固定液这类固定剂产生的固定相完全呈酸性反应，对染色质和核仁具有良好的固定，但是细胞内含物被溶解。

植物制片中应用的固定剂大多数属于这类固定剂。

（1）酒精-甲醛固定剂70%酒精100ml+甲醛10-20ml用于固定一般生物组织，不发生收缩，效果很好。

尤其用于在柱头上萌发的花粉管的固定。

染色质和核仁固定良好，内含物被溶解。

固定的时间通常为24小时，也可以作保存剂。

甲醛的用量可视材料而定。

（2）FAA固定剂（酒精-甲醛-冰醋酸固定剂）使用方便、效果较好、应用也最广。

可以固定一般植物材料和昆虫、甲壳类动物。