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一、实验目的本研究旨在克隆、鉴定某一生物X基因，并对其功能进行初步分析。
通过实验，了解基因克隆鉴定的基本原理和方法，为后续研究奠定基础。
二、实验材料1. 生物X样本：新鲜组织或细胞2. 总RNA提取试剂3. 反转录试剂盒4. PCR引物5. DNA分子量标准6. DNA回收试剂盒7. 载体DNA8. 连接酶9. 转化试剂10. 抗生素筛选培养基11. PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等三、实验方法1. 提取生物X样本的总RNA（1）将生物X样本进行研磨，加入适量裂解液，充分裂解细胞。
（2）加入适量RNA酶抑制剂，防止RNA降解。
（3）按照试剂盒说明书进行总RNA提取。
2. 反转录（1）按照反转录试剂盒说明书进行操作，将总RNA反转录为cDNA。
（2）设置反应体系：cDNA模板2μl，Oligo(dT)18引物1μl，5×反转录缓冲液4μl，dNTPs 2μl，M-MLV逆转录酶1μl，加ddH2O至20μl。
（3）反应条件：37℃ 60min，85℃ 5min。
3. PCR扩增（1）根据生物X基因的保守序列设计引物，并进行PCR扩增。
（2）设置反应体系：cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 2μl，Taq酶1μl，加ddH2O至25μl。
（3）反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。
4. DNA回收与连接（1）将PCR产物进行电泳检测，切取目的片段。
（2）按照DNA回收试剂盒说明书进行回收。
（3）将回收的DNA片段与载体DNA进行连接。
（4）连接体系：连接酶1μl，连接缓冲液2μl，载体DNA 1μl，DNA片段2μl，加ddH2O至20μl。
（5）16℃连接过夜。
5. 转化与筛选（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
（2）涂布于含抗生素的琼脂平板，37℃培养过夜。
（3）挑取单克隆菌落进行PCR鉴定。
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
一、实验目的1. 学习昆虫基因克隆的基本原理和方法；2. 掌握昆虫基因提取、PCR扩增、克隆、测序等实验技术；3. 了解昆虫基因在生物学研究中的应用。
二、实验原理昆虫基因克隆是指将昆虫体内的基因片段提取出来，并通过分子生物学手段将其克隆到载体上，从而在体外进行表达、研究等操作。
实验过程中主要包括以下步骤：1. 基因提取：从昆虫组织中提取DNA；2. PCR扩增：利用PCR技术扩增目标基因片段；3. 克隆：将扩增得到的基因片段克隆到载体上；4. 序列分析：对克隆的基因进行测序，分析其序列特征。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、核酸分析仪等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、克隆载体、限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶、质粒提取试剂盒、DNA测序试剂盒等；3. 实验材料：昆虫样品、细菌菌株等。
四、实验步骤1. 基因提取（1）将昆虫样品置于液氮中冷冻，然后研磨成粉末；（2）按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取昆虫DNA。
2. PCR扩增（1）设计特异性引物，针对目标基因序列；（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR反应，扩增目标基因片段。
3. 克隆（1）将PCR产物与克隆载体进行连接；（2）将连接产物转化到感受态细胞中；（3）在含抗生素的培养基中筛选阳性克隆。
4. 序列分析（1）提取阳性克隆的质粒；（2）按照DNA测序试剂盒说明书进行测序；（3）对测序结果进行比对和分析。
五、实验结果1. 成功提取到昆虫DNA；2. PCR扩增得到目标基因片段；3. 克隆得到阳性克隆；4. 对阳性克隆进行测序，获得目标基因序列。
六、实验讨论1. 基因提取过程中，选择合适的昆虫样品和提取方法至关重要，以保证DNA的质量和数量；2. PCR扩增过程中，引物设计、反应条件等因素对扩增结果有较大影响，需要根据实际情况进行调整；3. 克隆过程中，载体选择、转化方法等对克隆成功率有影响，需要根据实验需求选择合适的载体和转化方法；4. 序列分析过程中，比对和分析方法的选择对结果解读有较大影响，需要结合实验目的和序列特征进行选择。
转基因克隆动物的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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全基因组测序逐步克隆法的原理与流程分析全基因组测序逐步克隆法是一种常用的基因克隆方法，可以用于测定整个生物体的基因组序列。
该方法通过将DNA分子切割成多个较小的片段，逐步将这些片段克隆并测序，最终得到完整的基因组序列。
本文将对全基因组测序逐步克隆法的原理与流程进行详细分析。
一、原理全基因组测序逐步克隆法的原理基于Sanger测序技术和限制性内切酶切割的原理。
该方法先将DNA样本进行限制性内切酶切割，得到许多不同长度的DNA片段。
然后，这些DNA片段逐个进行克隆，并经过Sanger测序技术进行序列测定。
最后，根据测序结果，通过重叠匹配等方式将这些片段拼接起来，得到完整的基因组序列。
二、流程全基因组测序逐步克隆法的流程包括DNA提取、限制性内切酶切割、DNA片段克隆、Sanger测序和序列拼接几个关键步骤。
1. DNA提取：将感兴趣的生物体样本（如细胞、组织等）中的DNA提取出来。
这可以通过破碎细胞壁、裂解核膜等方式进行。
2. 限制性内切酶切割：将提取得到的DNA样本与适当的限制性内切酶一起反应，使得DNA分子在特定的酶切位点被切割成多个较小的片段。
这样做的目的是得到较小的DNA片段，方便后续的克隆和测序。
3. DNA片段克隆：将切割后的DNA片段克隆到合适的载体中，如质粒。
这可以通过PCR扩增、DNA连接等方法进行。
克隆得到的DNA片段形成了一个个克隆子，每个克隆子都携带着一个特定的DNA片段。
4. Sanger测序：对克隆得到的DNA片段进行测序。
通常采用Sanger测序技术，利用特殊的引物、有色荧光基团和催化测序反应来测定DNA片段的序列。
这个过程会产生一系列不同长度的读取片段，从而获得DNA片段的测序结果。
5. 序列拼接：根据Sanger测序结果，通过比对、重叠匹配等算法将不同的DNA片段拼接起来，得到整个基因组序列。
三、分析全基因组测序逐步克隆法具有如下几个优点和局限性：优点：1. 可以测定整个生物体的基因组序列，提供全面的遗传信息。
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4oC，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4oC，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。
此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA 1μg5× gDNA Eraser Buffer 2μLgDNA Eraser 1μLRNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反响液10μLRNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：(1) 37oC放置15 min；(2) 85oC，5 sec；(3) 4oC 保管。
一、实验目的1. 掌握基因克隆的基本原理和操作步骤；2. 学习基因克隆转化实验技术；3. 验证目的基因在受体细胞中的表达。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因从基因组中提取出来，并在受体细胞中稳定复制、表达的过程。
基因克隆转化实验主要包括以下步骤：目的基因的提取、克隆载体构建、目的基因与克隆载体的连接、转化受体细胞、筛选阳性克隆、鉴定阳性克隆等。
三、实验材料1. 材料：大肠杆菌DH5α、克隆载体pUC19、目的基因片段、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、离心机、恒温培养箱等；3. 试剂：LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等。
四、实验方法1. 目的基因的提取：采用PCR技术扩增目的基因片段，利用限制性内切酶将目的基因片段与克隆载体连接；2. 克隆载体构建：将目的基因片段与克隆载体pUC19连接，构建重组克隆载体；3. 转化受体细胞：将重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α中；4. 筛选阳性克隆：在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养转化后的菌落，挑选白色菌落进行PCR验证；5. 鉴定阳性克隆：对PCR验证阳性的菌落进行菌落PCR，将扩增产物进行电泳，观察条带是否与预期大小一致。
五、实验结果1. 目的基因提取：PCR扩增产物电泳结果显示，目的基因片段大小与预期一致；2. 克隆载体构建：重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α后，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，观察到白色菌落；3. 筛选阳性克隆：PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因片段；4. 鉴定阳性克隆：菌落PCR结果显示，阳性克隆中含有与预期大小一致的目的基因片段。
六、实验讨论1. 实验过程中，DNA连接酶和限制性内切酶的用量、转化效率等因素对实验结果有一定影响，需根据实际情况调整；2. 实验中，菌落PCR验证和鉴定阳性克隆是确保实验结果准确的关键步骤；3. 基因克隆转化实验技术在生物科研和生物医药领域具有广泛的应用前景。
基因克隆实验报告一、实验目的本次基因克隆实验的主要目的是从特定的生物体中获取感兴趣的基因，并将其插入到合适的载体中，以便进一步研究该基因的功能、表达和应用。
二、实验原理基因克隆是指通过一系列分子生物学技术，将一个目的基因从其所在的基因组中分离出来，并在体外进行扩增和修饰，然后将其连接到一个能够自我复制的载体分子上，形成重组 DNA 分子，最后将重组DNA 分子导入到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中稳定遗传和表达。
基因克隆的基本步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、目的基因与载体的连接、重组 DNA 分子的转化、重组子的筛选和鉴定等。
三、实验材料和试剂（一）实验材料1、含有目的基因的生物体样本，如细菌、植物或动物组织。
2、宿主细胞，如大肠杆菌。
（二）实验试剂1、限制性内切酶、DNA 连接酶。
2、聚合酶链式反应（PCR）所需的试剂，包括引物、dNTPs、Taq 聚合酶等。
3、琼脂糖、电泳缓冲液。
4、质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒。
5、抗生素，如氨苄青霉素。
四、实验步骤（一）目的基因的获取1、设计引物根据目的基因的序列，设计一对特异性引物。
引物的设计要考虑到引物的长度、GC 含量、Tm 值等因素，以确保引物能够有效地与目的基因结合，并在 PCR 反应中扩增出目的基因。
2、 PCR 扩增目的基因以生物体样本的基因组 DNA 为模板，进行 PCR 反应。
PCR 反应体系包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq 聚合酶和反应缓冲液。
PCR 反应条件包括预变性、变性、退火和延伸等步骤，通过多个循环的扩增，得到大量的目的基因片段。
（二）载体的选择和制备1、选择合适的载体根据实验目的和宿主细胞的特点，选择合适的载体。
常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
本实验中选择质粒作为载体。
2、制备线性化载体使用限制性内切酶对载体进行酶切，使其成为线性化的载体，以便于与目的基因进行连接。
（三）目的基因与载体的连接1、回收目的基因和线性化载体使用 DNA 凝胶回收试剂盒，分别回收 PCR 扩增得到的目的基因片段和线性化的载体片段。
原核或真核细胞基因克隆的实验方案
基因克隆是指将一个生物体的基因序列复制并导入到另一个生物体中。
下面是一个原核或真核细胞基因克隆的实验方案的概述：
原核细胞基因克隆实验方案如下：
1. 选择一个合适的质粒(vector)，如pUC19。
2. 从原核细胞中提取目标基因的DNA序列。
3. 将目标基因的DNA序列连接至质粒上的适当限制酶切位点，形成重组质粒。
4. 将重组质粒转化至宿主细菌中，如大肠杆菌。
5. 在含有适当选择性培养基的培养皿中培养转化后的细菌。
6. 通过筛选克隆检测获得目标基因被成功插入质粒的细菌。
7. 最后，提取重组质粒中的目标基因。
真核细胞基因克隆实验方案如下：
1. 选择一个合适的真核细胞载体(vector)，如pCDNA3.
2. 将目标基因的DNA序列放入真核细胞载体中，形成重组载体。
3. 将重组载体转染入真核细胞中，如哺乳动物细胞。
4. 在培养基中培养转染后的真核细胞。
5. 筛选和收集含有目标基因的克隆细胞。
6. 验证克隆细胞中目标基因的存在，如通过PCR或DNA测序等方法。
7. 最终，可通过克隆细胞培养、提取目标基因的方式获得目标基因。
在进行任何实验操作前，请确保遵守实验室的安全规范和伦理要求，并获得相应的研究伦理审批。
分子克隆实验流程分子克隆是将DNA分子从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
这种技术广泛应用于生物学研究和生物工程领域。
下面将详细介绍分子克隆的实验流程。
1.提取DNA首先，需要从源生物体中提取所需的DNA。
这可以通过不同的方法来完成，例如琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR和基因组DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要是目标基因的完整、纯净的样本。
2.回收DNA片段将提取的DNA片段和载体（例如质粒）切割，以回收想要克隆的DNA 片段。
常用的酶剪切酶包括限制性内切酶和退火酶。
将酶切割后的DNA片段与载体的切割端黏合，形成重组DNA。
3.转化纯化将重组DNA转化到宿主细胞中。
通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
这可以通过脉冲电击、热激转化或化学转化来实现。
这一步的目的是将重组DNA导入到宿主细胞中，以便宿主细胞可以复制和表达克隆的DNA。
4.鉴定克隆细胞通常，我们通过选择性培养、荧光染色、PCR检测等方法来鉴定具有克隆DNA的细胞。
在选择性培养基上生长可以表明细胞成功地接受了重组DNA。
此外，如果重组DNA带有可观察的荧光标记，可以使用荧光显微镜进行观察。
PCR检测可以验证目标基因的存在。
5.扩增克隆细胞选取鉴定出的克隆细胞进行扩增。
这可以通过将克隆细胞培养在含有选择性抗生素的培养基上来实现。
只有带有插入DNA的细胞可以在这种培养条件下生存。
选择性培养的目的是增加克隆细胞的数量，以便后续的实验。
6.提取插入DNA从扩增的克隆细胞中提取含有插入DNA的重组质粒。
通常使用薄膜过滤法将细菌细胞去除，然后使用DNA提取试剂盒从细菌残渣中提取质粒。
提取的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化和鉴定。
7.鉴定插入DNA使用不同的试验方法来鉴定插入DNA的准确性和完整性。
这可能包括核酸测序、酶切鉴定、PCR扩增等。
通过这些方法可以验证克隆的DNA是否与目标基因的序列完全一致。
8.进一步应用得到插入DNA后，可以进行进一步的应用，例如重组蛋白表达、基因改良、产生转基因生物等。
cDNA基因克隆的原理和步骤基因克隆是分子生物学中一项重要的技术，它使得科研人员能够克隆、扩增和研究特定基因序列，为基因功能和调控机制的研究提供了强有力的工具。
cDNA克隆则是基因克隆的一种常见形式，它通过将mRNA 转录为DNA并将其插入细菌质粒中，用于研究基因的表达和功能。
本文将详细介绍基因克隆和cDNA克隆的原理和步骤。
一、基因克隆的原理和步骤基因克隆是将目标基因从宿主生物体中剪切出来，并将其克隆到载体分子中的过程。
基因克隆的原理和步骤如下：1. 分离目标基因：从生物体中提取DNA，并使用限制性内切酶切割目标基因的DNA序列。
限制性内切酶是一类能够在特定的核酸序列上切割DNA的酶。
通过选择适当的限制性内切酶，可以剪切出目标基因的特定DNA片段。
2. 构建载体分子：选择一个适当的载体分子，如质粒，将其进行限制性内切酶切割。
切割后的载体分子将产生两个或多个裂开的末端。
3. 连接目标基因和载体：将目标基因的DNA片段与裂开的载体分子末端进行连接。
这个过程需要使用DNA连接酶，如T4 DNA连接酶。
DNA连接酶能够将两个DNA片段连接在一起，形成一个完整的DNA分子。
4. 转化宿主细胞：将连接好的目标基因和载体分子转化到宿主细胞中。
通常使用大肠杆菌作为宿主细胞，转化过程中使用适当的选择性培养基，如含有抗生素的培养基。
只有带有目标基因和载体的细胞才能在选择性培养基上生长。
5. 筛选和鉴定：经过转化和培养后，筛选出含有目标基因的克隆细胞。
常用的鉴定方法包括PCR分析，限制性内切酶切割和DNA测序等。
这些方法可以验证克隆细胞是否含有目标基因，并确认其序列是否正确。
二、cDNA克隆的原理和步骤cDNA克隆是将mRNA转录为DNA并将其插入细菌质粒中的过程，用于研究基因的表达和功能。
cDNA克隆的原理和步骤如下：1. 分离mRNA：从细胞中分离出总RNA，然后使用反转录酶将mRNA转录为cDNA。
反转录酶是一种与RNA相关的DNA聚合酶，它能够使用RNA作为模板合成cDNA的第一链。
基因克隆具体实验报告基因克隆是指将一个物种的基因从其源生物体中提取出来，并插入到另一个宿主生物体中的过程。
基因克隆可以用于基础研究、医学诊断和治疗、农业改良等领域。
以下是一个基因克隆具体实验的报告。
实验目的：本实验旨在将一段目标DNA序列从一个细菌中克隆到另一个细菌中，以验证克隆技术的可行性。
实验材料：- 源生菌株：提供目标DNA序列的细菌- 宿主菌株：用于接受目标DNA序列并进行复制的细菌- 高浓度DNA提取试剂盒：用于提取源生菌株中的基因组DNA- 质粒：使用质粒介导转化的方式将目标DNA序列插入到质粒中- 缓冲液：用于稀释DNA、提供合适的反应环境- 培养基：提供细菌生长所需的养分- 抗生素：用于选择具有目标DNA序列的细菌实验步骤：1. 提取源生菌株中的基因组DNA：a. 从培养基中取一些源生菌落，转移到离心管中。
b. 加入适量的高浓度DNA提取试剂盒，根据试剂盒说明书进行细胞破裂和DNA纯化的步骤。
c. 将提取的DNA用缓冲液稀释，并进行质量检查。
2. 克隆目标DNA序列到质粒中：a. 将提取的DNA和质粒按照一定比例混合。
b. 加入适量的酶切酶，根据目标DNA序列的酶切位点选择适当的酶切方法。
c. 在恒温水浴中进行酶切反应，使目标DNA序列与质粒酶切后的末端互补连接。
d. 加入适量的合成DNA ligase，进行连接反应，形成目标DNA序列与质粒的连接产物。
3. 将质粒插入宿主细菌：a. 将宿主细菌制备成化学计量的细菌悬液。
b. 加入目标DNA序列与质粒连接产物到宿主细菌悬液中。
c. 进行质粒介导转化，使目标DNA序列与质粒插入到宿主细菌中。
4. 筛选具有目标DNA序列的细菌：a. 将转化后的宿主细菌悬液分别均匀涂布在含有适量抗生素的培养基平板上。
b. 在适当的培养条件下，培养细菌培养基平板，并观察是否有菌落生长。
c. 通过PCR、酶切等方法对菌落进行初步筛选。
d. 对初步筛选出的菌落进行进一步的测序和验证。
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
一、 组织总RNA的提取 相关试剂：Trizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1. 取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2. 转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3. 按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4. 4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5. 小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6. 室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7. 弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8. 弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9. 弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10. 沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）
相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）
（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。 二、 逆转录（RNA逆转录成cDNA） 相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl冰盒，制冰机，PCR管）
根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下： 试剂 使用量（μl） Rnase Free H2O 11.75-Y Oligo（dT） 1 Total RNA（<1000ng） Y Total Volume 12.75 65℃，5min后，立即置于冰上。 试剂 使用量（μl） 上一步变性后RNA溶液 12.75 5×RT Buffer 4 dNTP Mixture（各10mM） 2 Rnase Inhibitor（10U/μl） 0.25 Rever Tra Ace 1 Total Volume 20 然后放置于PCR仪上，反应程序为： 42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。所得cDNA放置于-20℃保存。
三、 PCR反应 相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。 反应结束后，取5μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
试剂 使用量（μl） ddH2O 6.0 反转录产物 1.0 10×PCR Buffer 1.0 dNTP（10mmol/l） 0.2 Taq酶（1U/μl） 0.4 Ghrelin-F（10μmol/l） 0.4 Ghrelin-R（10μmol/l） 0.4 MgCl2（25mmol/l） 0.6 Total Volume 10 四、 PCR产物的分离，回收和纯化 相关试剂：胶回收试剂盒 相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）
相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架） PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于-20℃。
五、 目的片段与载体的连接 相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）
按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。 pMD-18T载体 1μl DNA 2μl ddH2O 2μl 然后加入5μl Ligation Mix，4℃/16℃放置 过夜连接。
六、 转化 相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）
CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞
全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。 （1）以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h； （2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h； （3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低） （4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min； （6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min； （7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清； （8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl在冰上分装。-80℃保存备用。 连接产物转化到感受态细胞 （1）将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min； （2）然后放到42℃水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min； （3）加入890μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min； （4）每个培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸取100μl菌液，均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平板上； （5）37℃培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生） 七、 菌液PCR检测 相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
在平板上挑取10～20个白色菌落，加入含有1ml Amp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃震荡培养6h。3000rpm离心3min后吸掉上层400μl上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。
附注： 主要溶液和培养基的配制 1）电泳缓冲液10×TBE：108g Tris碱，55g 硼酸，20ml 0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0； 2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃保存； 3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4℃保存； 4）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃保存。使用时终浓度为100ug/ml。 5）用于制备感受态细胞的CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56g CaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌； 6）X-gal（20mg/ml）的配制：将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存； 7）IPTG（200mg/ml）的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm滤膜除菌，-20℃保存备用； 3’RACE （dT）17-接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 17 3’ 接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CG 3’ 1. cDNA的合成 DEPC水 9.75μl Oligo dT 接头引物 1μl Total RNA 2μl (<1000ng) 65℃,5min；立即置于冰上。 第一步变性后的RNA溶液 12.75μl 5×RT Buffer 4μl dNTP Mixture（各10mM） 2μl Rnase Inhibitor（40U/μl） 0.25μl Rever Tra Ace 1μl 总体积 20μl 反应条件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。 2. cDNA的纯化 利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。最后使用20μl TE洗脱沉淀。 3. 第一轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl Oligo dT 接头引物(10μmol/L) 0.4μl 3’RACE外引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。 PCR产物稀释10倍作为模板进行下游实验。 4. 第二轮PCR cDNA 1μl 10×Buffer 1μl dNTP（10mmol/L） 0.2μl 接头引物(10μmol/L) 0.4μl 3’RACE内引物(10μmol/L) 0.4μl Taq酶(1U/μl) 0.4μl MgCl2（25mmol/L） 0.6μl ddH2O 6.0μl 反应条件：降落PCR。
