2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤）冰冻切片操作方法及步骤：1取材：(昆明小鼠各个组织或器官)取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
2包埋：取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。
3修平：将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。
4切片：调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
5调防卷板：制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。
这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。
冰冻切片时的注意事项：1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。
有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。
因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。
临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。
冰冻切片染色的步骤如下：
冰冻切片染色的步骤如下：
1.配制染色液和分化液。
根据所需的染色效果，配制染色液和分化液。
例如，
伊红染色液的配方是在95%乙醇100ml中加入1g伊红，玻璃棒搅拌均匀；
1%盐酸酒精分化液的配方是36%-38%的盐酸1ml加入75%乙醇99ml中混匀。
2.将切片放入苏木精染液中染色一定时间，根据实际需要决定染色时间。
3.自来水洗去浮色。
4.进入分化液进行分化处理。
5.自来水冲洗半小时以上，使切片蓝化。
6.过滤后加入伊红染色液染色一定时间。
7.再次自来水洗去浮色。
8.加入伊红染色液染色一定时间，使切片呈现出所需的染色效果。
9.最后进行脱水、透明、封片等处理，完成染色过程。
请注意，在进行冰冻切片染色时，应调整试剂和制片过程中各步骤的时间，所制冰冻切片应染色鲜明，结构清晰。
冷冻切片常见问题与解决方法叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)009【总页数】2页(P1030-1031)【关键词】冷冻切片;取材;包埋;发白;染色【作者】叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【作者单位】上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030【正文语种】中文【中图分类】R361.2术中冷冻切片是目前临床病理检查中最常用的快速制片方法之一。
其是在低温下将新鲜组织冷冻至一定硬度，然后再进行切片的制片方法。
由于低温时组织细胞会损伤、组织细胞着色力差及短时间内快速出片等因素的影响，制片过程中常会出现空洞和冰晶、组织细胞变形和皱缩、切片染色背景不清晰、颜色对比不协调、发白等问题。
现将上述问题及处理方法讨论如下。
1 常见问题与解决方法［1］1.1 冷冻切片出现空洞和冰晶现象(图1) (1)原因:组织内有过多水分，脱水不过关、取材时遇到水，冷冻时间过长，组织冷冻的温度过低。
(2)对策:①取材大小、厚薄要适宜，过大、过厚影响冷冻速度。
②新鲜组织应避免遇水，取材器械干燥洁净，若组织本身带水或血较多，用滤纸把水或血吸干。
取材后需用合成胶水或OCT 作组织块包埋剂，进行包埋。
合成胶水和OCT 均具有黏稠性和渗透性，能将组织牢固地固定在冷冻头上。
③冷冻时间要短，只有速冻才能减少组织内冰晶的形成，最好将速冻头压在组织上，冻好后便可切片，对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采取干冰或液态氮冷冻，以减少冰晶形成。
④以冷冻切片机设置的温度(冷冻头OT 为－25 ℃，CT 为－20 ℃)为宜。
温度太低，组织容易变脆、变硬，切片易出现空洞现象。
1.2 组织破碎或形成空洞现象(图2) (1)原因:组织冷冻时间过长;组织比较硬、脆。
(2)对策:可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。
