反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎

第37卷第3期西南师范大学学报(自然科学版)2012年3月V o l.37N o.3J o u r n a l o f S o u t h w e s t C h i n aN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)M a r.2012文章编号:10005471(2012)03011307反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究①赖国旗1,2,张文露1,胡源1,唐红1,张磊1,谢素兰1,潘玥2,魏立雯2,黄爱龙11.重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆400016;2.重庆医科大学实验动物中心,重庆400016摘要:目的:建立起简单㊁快速㊁灵敏㊁准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(r e v e r s e l i n ep r o b e,R L P)检测方法.方法:根据H B V野生及耐药基因序列设计通用探针㊁3 ㊁5 对称加有p o l y-C的特异性探针和5 标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使H B VP C R扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立R L P检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式P C R可对103拷贝/m l的血清样本进行有效特异扩增,新建的R L P检测方法可对P C R扩增产物在1n g/m l以上,或血清样本中突变型D N A占野生型D N A比例为5%以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100%,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09%(103/105)㊁100%(43/43),与直接测序法比,R L P检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测H B V拉米夫定耐药位点方便㊁灵敏㊁准确,是H B V拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.关键词:反向线性探针杂交;乙型肝炎病毒;拉米夫定中图分类号:Q819文献标志码:A乙型肝炎病毒(h e p a t i t i sBv i r u s,H B V)感染引起的慢性乙型肝炎(c h r o n i c h e p a t i t i sB,C H B)以及相关的肝硬化(l i v e r c i r r h o s i s,L C)㊁肝细胞癌(h e p a t i c c e l l c a n c e r,H C C)和肝功能衰竭是全球范围内重要的医学和公共卫生问题[1].干扰素α(I F Nα)和核苷(酸)类似物(n u c l e o s i d e a n a l o g u e s,N A)是目前治疗C H B主要的两类抗病毒治疗药物.其中,N A口服方便㊁抑制H B V D N A复制的效果明显㊁长期使用安全性良好,尤其是当免疫治疗失败时,N A在C H B的抗病毒治疗中具有明显的优势,受到广大临床医师和患者的重视.但是,长期使用N A抗病毒治疗的过程中,耐药毒株的产生是一个突出的问题,它不仅影响现有药物的治疗效果,同时由于交叉耐药的存在,可能影响后续治疗方案的选择和治疗作用的发挥,最终将导致肝病恶化[2].尤其是最常用的N A 拉米夫定,常出现L180M和M204I/V突变[3].目前,已有各种拉米夫定耐药突变的检测方法,如实时荧光P C R㊁限制性片段长度多态性㊁基因芯片㊁D N A测序等[4-5],其中, D N A测序是耐药检测的金标准,但其对基因型混合耐药的检出率低.I n n o g e n e t i c s公司生产的反向线性探针分析(I N N O-L i P A)试剂盒在乙肝病毒耐药检测中得到应用[6-9],I N N O-L i P A与其它检测方法比较,在①收稿日期:20110712基金项目: 863 课题(G r a n tN o.2008A A02Z424)和重庆市教委课题(G r a n tN oK J100309).作者简介:赖国旗(1964),女,重庆人,副教授,医学博士,博士后,主要从事感染性疾病分子生物学研究.通信作者:黄爱龙,教授.411西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第37卷疾病进展处于高风险时具有明显优势.但是,I N N O-L i P A检测试剂盒价格昂贵,检测试剂条探针数量多,结果判断复杂,现仅限于实验研究,短期内很难在临床推广使用.因此,建立快速㊁简便,特异性好㊁灵敏度高的检测方法非常必要.本研究是探讨反向线性探针(r e v e r s e l i n e p r o b e,R L P)检测拉米夫定耐药的新方法.1材料与方法1.1材料1.1.1细菌与试剂大肠杆菌E.c o l iD H5α由本室保存,T a q D N A聚合酶和p M D18T载体㊁柱式液体样品总核酸抽提试剂盒购自T a K a R a公司,生物素抗体-碱性磷酸酶(H R P)酶联底物N B T/B C I P购自R o c h e公司,R e a l-t i m eP C R试剂盒购自F o s u nD i a g n o s t i c s公司,硝酸纤维膜购自G E公司,其余试剂为国产分析纯. 1.1.2血清标本86份H B V阳性血清标本由重庆医科大学附属第二医院感染科提供.1.1.3仪器S1000T M T h e r m a l c y c l e rP C R仪购自B I O-R A D公司,3100测序仪购自A B I公司,凝胶成像仪购自B i o R a d公司,X Y Z3050F划膜仪购自B I O D O T基因有限公司,H L2000分子杂交仪购自U V P公司,恒温振荡培养箱购自江苏太仓科教仪器厂.1.2方法1.2.1 H B V野生型和耐药型标准质粒构建根据测序结果为L180/M204㊁L180M/M204I㊁L180M/M204V的病人血清进行R T区P C R扩增,将扩增的P C R产物克隆在p M D18T质粒载体上,并通过测序筛选,构建H B V野生型和拉米夫定耐药型标准质粒.1.2.2引物和探针采用T r e e v i e w软件对N C B I中891条H B V全长序列进行比对分析,根据序列保守区设计通用探针和巢式P C R扩增引物,上游引物在5 端进行生物素修饰.根据耐药位点的特异性设计(简并)探针(表1),由I n v i t r o g e n e公司合成.表1H B VP C R引物及寡核苷酸探针P C R引物序列570F B P(外上游引物)5 -B i o t i n-T G T T G C T G T A C A A A A C C T-3610F B P(内上游引物)5 -B i o t i n-T G T A T T C C C A T C C C A T C A T C-31180R B P(下游引物)5 -T C A G C A A A C A C T T G G C A-3P r o b e sC D R705(通用探针)5 -A C A G T G G G G G A A A G C C C T-3L180(180野生探针)5 -d C-T A A A C T G A G C C A R*G A G A-d C-3L180M(180耐药探针)5 -d C-T A A A C T G A G C C A T G A G A-d C-3M204(204野生探针)5 -d C-A T C A T CC A T A T A A C T G A-d C-3M204I(204耐药探针)5 -d C-A C A T C A T CD*A T A T A A C T-d C-3M204V(204耐药探针)5 -d C-A T C A T CC A C A T A A C T G A-d C-3*R=G/A,D=T/G/A.1.2.3 H B V D N A提取按 柱式液体样品总核酸抽提试剂盒 提取D N A.200μL血清样本中加入200μL2ˑ裂解缓冲液(0.02 m o l/LT r i s.H C l,0.01m o l/LE D T A,1%S D S)和10μL蛋白酶K K(20m g/m L),40ħ消化1.5h,用酚和氯仿抽提后用无水乙醇沉淀D N A,75%乙醇洗涤后用20μL纯水溶解D N A,按 R e a l-t i m e P C R试剂盒 测定H B V D N A拷贝数.1.2.4 H B VP 基因D N A 扩增反应体系总体积为50μL ,内外扩增引物序列见表1.外扩增反应条件:94ħ预变性4m i n ,94ħ变性30s ,56ħ退火40s ,72ħ延伸50s ,35个循环,72ħ延伸10m i n .内扩增反应条件:94ħ预变性4m i n ,94ħ变性50s ,46ħ退火40s ,72ħ延伸30s ,35个循环,72ħ延伸10m i n .取5μLP C R 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳.图1 H B V 拉米夫定耐药检测试纸条示意图1.2.5 R L P 杂交条件优化及特异性检测1)杂交膜的制备:将生物素标记的H B VP C R 扩增产物稀释3n g /μL ,作为显色阳性对照,将通用探针及寡核苷酸探针(p o l y -5C ㊁10C ㊁15C 或20C )配制成20μm o l /L ,用划膜仪按显色对照㊁通用探针㊁L 180㊁180M ㊁M 204㊁204I ㊁204V 顺序线性喷洒于硝酸纤维膜上(图1),膜片经紫外交联后,120ħ烘烤30m i n ,室温干燥保存.2)杂交条件优化:将每条膜片浸泡在2m L45ħ预热的杂交液(2ˑS S C ,0.1%S D S )中,加入20μLP C R 变性产物(10μL 标准质粒P C R 产物㊁10μL 变性液,混合处理10m i n ),50ħ㊁53ħ或56ħ杂交30m i n㊁60m i n 或90m i n .3)洗膜和显色:杂交完后,用杂交液室温漂洗2次,5m i n/次,洗脱液(0.5ˑS S C ,0.1%S D S )50ħ洗脱30m i n ,T B S 室温漂洗5m i n .将膜片浸泡于2m L 生物素抗体碱性磷酸酶A P 溶液(含T T B S2m L ㊁B S A0.1g ㊁A P 0.1μL ㊁0.2μL 或0.4μL )中,25ħ30m i n ,然后用T B S 室温漂洗5m i n ,显色缓冲液25ħ洗膜2次,每次5m i n .最后将膜浸入2m L N B T /B C I P 显色液(显色缓冲液2m L ㊁N B T /B C I P 40μl )中,25ħ避光显色30m i n,蒸馏水终止反应,根据紫色线条出现的位置和顺序直接判断结果.1.2.6 灵敏度检测1)用半巢式P C R 扩增103c o p y /m l ~108c o p y /m l 标准质粒D N A ;2)用R L P 检测方法检测0.1,1.0,10n g/m L 的标准质粒P C R 产物;3)用R L P 检测方法检测按100ʒ0,95ʒ5,90ʒ10,80ʒ20,70ʒ30比例进行混合的野生型:突变型质粒P C R 产物.1.2.7 临床样本耐药检测用优化的R L P 检测方法检测86例拉米夫定治疗后的慢性乙型肝炎病毒血清样本,同时对这86例样本的P C R 产物直接测序(本实验室完成),如R L P 检测结果与测序结果有冲突,则进行T 载体克隆,选择30个克隆,再进行测序.2 结果2.1 H B VP 基因D N A 扩增以H B V 标准质粒为模板进行内扩增,野生型和突变型质粒在570b p 处可见阳性条带,与预期片段大小一致(图2).图2 H B VP 基因D N A 扩增产物琼脂糖凝胶电泳511第3期 赖国旗,等:反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究2.2 血清样本H B V 半巢式P C R 扩增H B V 阳性血清样本经过P C R 外扩增和内扩增,图3a 为8例血清样本的外扩增结果,其中1~5,7和8号样本在610b p 处出现很亮的条带,与预期片段大小一致;6号样本没有阳性条带,荧光定量P C R 测定表明这例病毒拷贝数为103拷贝/m l .对6号样本进行内扩增后在570b p 出现条带,与预期片段大小一致(图3b ).结果表明通过半巢式P C R 可对103拷贝/m l 的血清样本进行有效扩增,并且特异性较好.a .外引物扩增结果 1~8:样本扩增结果;N C :阴性对照b .内引物扩增结果 1:对应外扩增的6泳道(拷贝数为103c o p y /m l )图3 巢式P C R 扩增不同拷贝数的临床样本1:野生型P C R 产物;2:180M /204I P C R 产物;3:180M /204VP C R 产物L 180-20C ,M 204-5C ,204I -5C ,204V -5C ,56ħ30m i n ,抗体浓度为1ʒ5000图4 拉米夫啶耐药线性杂交条件优化及特异性检测2.3 R L P 杂交优化及其检测特异性180及204位点探针3 ㊁5 端对称用不同b p 的d C 修饰(5C ㊁10C ㊁15C ㊁20C ),在3个温度(50ħ㊁53ħ㊁56ħ)下杂交不同时间(0.5h ㊁1h ㊁1.5h ),在25ħ条件下与不同的A P 抗体浓度(1ʒ15000㊁1ʒ10000㊁1ʒ5000)结合,结果发现探针L 180-20C ,M 204-5C ,204I -5C ,204V -5C ㊁杂交温度为56ħ㊁杂交时间30m i n ㊁抗体浓度为1ʒ5000信号强度最好,且无非特异性条带出现(图4).2.4 R L P 杂交检测灵敏度用半巢式P C R 进行扩增不同拷贝数标准质粒,当质粒为103拷贝/m l 时,可见阳性条带(图5a );用R L P 检测方法检测不同浓度标准质粒P C R 产物,P C R 产物浓度为为1n g /m l 时,能被检出(图5b );用R L P 杂交野生型与突变型P C R 产物不同混合比例,突变型占野生型比例为5%时,均可被检出(图5c ).2.5 临床样本检测用建立的反向线性探针杂交法检测86例临床血清样本,86份临床样本中,所有样本都得到有效扩增和检测,其灵敏度为100%,用R L P 检测结果与测序法进行比较,R L P 检出L 180位点和M 204位点共103个,而测611西南师范大学学报(自然科学版) h t t p ://x b b jb .s w u .c n 第37卷序法检出L 180位点和M 204位点共105个,R L P 的对野生位点检测准确性为98.09%(103/105).R L P 检出180M 位点㊁204I 位点和204V 位点共43个,与测序法其检测结果一致,R L P 对耐药位点检测准确性为100%.R L P 检出混合型(L 180M ㊁M 204I /V )位点4个,而测序法检出混合型2个,对与测序法不同的两例血清进行T 载体克隆,再进行测序,其结果与R L P 检测结果一致(表2).a .巢式P C R 扩增不同拷贝数样本:1~7泳道为拷贝数分别为103c o p y /m l ~108c o p y/m l 的质粒;b .不同浓度标准质粒P C R 产物:1~3为野生型质粒P C R 产物,4~6为180M /204I 质粒P C R 产物,7~9为180M /204V 质粒P C R 产物;1㊁4㊁7:10n g /m L ,2㊁5㊁8:1n g /m L ,3㊁6㊁9:0.1n g /m L ;c .野生型与突变型不同比例杂交结果.1:野生型与180M /204I 混合物;2:野生型与180M /204V 混合物.图5 拉米夫定反向线性杂交灵敏度检测表2 反向线性探针检测临床样本结果编码反向线性杂交野生型突变型混合型测 序野生型突变型混合型18056172581702044726247262T o t a l 1034341054323 讨 论目前,全球有3.5亿人为慢性H B V 携带者,其中我国慢性H B V 携带者近一亿人.H B V 感染不仅可导致急㊁慢性病毒性肝炎,而且约20%~30%感染者因H B V 相关疾病死亡.我国每年用于H B V 感染患者711第3期 赖国旗,等:反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究811西南师范大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第37卷的医疗和保健费用高达1000亿人民币,H B V感染是危害人民健康和造成国民经济损失最严重的疾病之一[10-12].拉米夫定是最早用于临床的的主要核苷类似物,其抗病毒作用是通过作用于H B V逆转录酶,在细胞内磷酸化为三磷酸酯形式结合在病毒D N A链的3 端.拉米夫定用于治疗慢性乙肝患者相对其它核苷(酸)类似物更易产生耐药,用药后第1年至第4年,其耐药发生率分别是14%,38%,49%和66%[13-14],严重影响慢性乙肝患者的治疗.反向线性探针杂交是先将已知探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,与5 端标记生物素引物的P C R扩增的产物杂交,再经相应的显色反应就能显出杂交信号.P C R是否有效扩增㊁探针固定方法㊁杂交温度㊁时间㊁抗体浓度等是影响检测方法灵敏度和特异性的重要因素.本实验采用半巢式P C R可有效扩增103拷贝/m l的D N A.在合成的寡核苷酸探针两端采用酶学的方法加上寡聚多胸腺嘧啶(d C)的尾,采用紫外线照射铰链和高温烘烤相结合的方法增加了探针固定效率.经过优化,确定探针L180-20C,M204-5C,204I-5C,204V-5C㊁杂交温度为56ħ㊁杂交时间30m i n㊁抗体浓度为1ʒ5000信号强度最好,且无非特异性条带出现.同时,在探针序列设计上采用了简并的方法,与I N N O-L i P A试剂盒相比,既减少了探针的数量,又保证了试剂条对同一位耐药点多种突变形式的检测,检测结果简洁㊁直观.R L P检测程序经过优化后,无须预杂交,其检测时间相对I N N O-L i P A检测试剂盒更快,检测仅需2h左右.通过对86例临床样本的R L P检测方法检测,其灵敏度为100%,R L P检测结果与测序法进行比较, R L P的对野生位点检测准确性为98.09%,对耐药位点检测准确性为100%.R L P检测灵敏高,当P C R产物为1n g/m l,或当突变型占野生型比例为5%时,R L P检测方法可有效检出.根据克隆测序证实,R L P对混合型耐药位点的检测比测序法更好.总之,本实验所建R L P杂交检测方法检测H B V拉米夫定耐药灵敏㊁准确㊁简洁㊁快速,是H B V拉米夫定治疗有效的监控工具,便于基层单位推广使用.参考文献:[1]E u r o p e a nA s s o c i a t i o n f o r 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fL a m i v u d i n e -R e s i s t a n t C h r o n i cH e pa t i t i sBV i r u s L A IG u o -q i 1,2, Z HA N G W e n -l u 1, HU Y u a n 1,T A N G H o n g 1, Z HA N G L e i 1, X I ES u -l a n 1,P A N Y u e 2, W E IL i -w e n 2, HU A N G A i -l o n g 11.K e y L a b o r a t o r y o fM o l e c u l a r B i o l o g y o n I n f e c t i o u sD i s e a s e s ,M i n i s t r y o f E d u c a t i o n ,C h o n g q i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400016,C h i n a ;2.L a b o r a t o r y A n i m a l C e n t e r ,C h o n g q i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400016,C h i n a A b s t r a c t :O b j e c t i v e :T o e s t a b l i s h a s i m p l e ,r a pi d ,s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e r e s e r v e l i n e p r o b e (R L P )m e t h o d f o r t h e d e t e c t i o no f c h r o n i c H B V (h e p a t i t i sBv i r u s )l a m i v u d i n e -r e s i s t a n t l o c u s .M e t h o d s :B a s e do nt h e g e n e s e q u e n c e o fH B V w i l d -t y p e a n d l a m i v u d i n e -r e s i s t a n t d r u g ,u n i v e r s a l p r o b e ,s p e c i f i c p r o b eo f 3 ,5 a d d e d p o l y -Ca n d p r i m e r s o f 5 l a b e l e db i o t i nw e r e d e s i g n e d .T h e s p e c i f i c p r o b e sw e r e f i x e do n t h en i t r o -c e l l u l o s em e m b r a n e l i n e a r ;s o a s t om a k eH B VP C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s h y b r i d i z ew i t h t h e p r o b e s .B yo p t i m i z i n g t h eh y b r i d i z a t i o nc o n d i t i o n s ,ar e v e r s e l i n e p r o b eh yb r i d i z a t i o nt e s tm e t h o d w a se s t a b l i s h e d ,w h ic hw a s t h e nu s ed t o de t e c t 86c h r o n i c h e p a t i t i s B p a t i e n t s i nC h o n g q i n g ,a n d t h e r e s u l t sw e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e of t h e d i r e c t s e q u e n c i ng m e th o d .R e s u l t s :O n t h e c o n di t i o n t h a tH B V D N Ai n t h e s e r u m h a d m o r e t h a n103c o p i e s /m l ,i t c o u l db e a m p l i f i e de f f e c t i v e l y b y s e m i -n e s t e dP C R.A t t h e s a m e t i m e ,w h e n c D N A w a sm o r e t h a n 1n g /m l o r t h em u t a n t p r o p o r t i o nw a sm o r e t h a n 5%i nw i l d -t y p e o f s e r u ms a m p l e s ,l a m i v u d i n e -r e s i s t a n t t o c h r o n i c h e p a t i t i s Bv i r u s c o u l d b e e f f e c t i v e l y d e t e c t e d b y t h e n e wR L Ph y b r i d i z a t i o n m e t h o d .T h e s e n s i t i v i t y i n 86c l i n i c c a s e sw a s 100%(86/86).T h e d e t e c t i o n a c c u r a c y o f t h ew i l d t y pe a n d t h e d r u g r e s i s t a n t t y p ew a s 98.09%(103/105),100%(43/43),r e s p e c t i v e l y.C o n c l u s i o n s :T h e r e v e r s e l i n e a r p r o b eh y b r i d i z a t i o nm e t h o d t oH B Vl a m i v u d i n e r e s i s t a n c e i s c o n v e n i e n t ,s e n s i t i v e a n d a c c u r a t e .I t i s a ne f f e c t i v em o n i t o r i n g t o o l f o rH B Vl a m i v u d i n e t h e r a p y a n d s u i t a b l e f o r c l i n i c a l a p p l i c a t i o n .K e y w o r d s :r e v e r s e l i n e p r o b eh y b r i d i z a t i o n ;h e p a t i t i sBv i r u s ;l a m i v u d i n e 责任编辑 汤振金 911第3期 赖国旗,等:反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究。