原位杂交技术

原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。

该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。

原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。

2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。

3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。

标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。

4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。

5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。

6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。

原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。

它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。

此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。

总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。

原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。

其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。

原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。

这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。

该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。

但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。

我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。

整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。

分子生物学研究中的原位杂交技术1. 引言原位杂交技术(In Situ Hybridization，ISH)是一种分子生物学研究中常用的重要技术方法，它在研究基因功能、表达、定位和疾病等方面具有广泛的应用。

通过掌握ISH技术的基础知识和基本操作，可以为分子生物学的深入研究提供强有力的工具。

2. 背景知识ISH技术是通过将DNA或RNA探针与待检测物品（如细胞、组织、染色体等）发生靶向杂交反应，从而探究DNA和RNA序列在待检测物品内的分布、表达及功能等。

利用双链DNA分子中序列互补的特性，ISH技术可以检测同源性的DNA或RNA序列，并确定它们在待检测物品内的位置。

ISH技术有多种类型，其中包括原位DNA杂交（In Situ DNA Hybridization，ISDH）、细胞核流式原位杂交（Fluorescence InSitu Hybridization of Interphase Nuclei，FISH）、原位RNA杂交（In Situ RNA Hybridization，ISR）等。

FISH是目前应用最广泛的一种ISH技术，它能够在细胞核级别上进行检测，解决了ISDH只能检测染色体水平的限制。

3. 原位DNA杂交 (ISDH)ISDH技术是通过从待检测物品中提取DNA标记探针，利用其与待检测物品DNA发生互补杂交来实现。

它能够检测到DNA分子的位置和数量，并确定待检测物品中特定DNA序列的分布。

ISDH的操作步骤主要包括：（1）待检测物品的准备和固定；（2）DNA探针的制备和标记；（3）探针与待检测物品DNA的杂交；（4）洗涤和显色。

4. 细胞核流式原位杂交 (FISH)FISH技术是通过使用荧光探针，将荧光标记的DNA探针与待检测物品的染色体DNA或RNA发生互补杂交反应，直接在细胞核水平上检测DNA序列的位置和数量。

FISH技术不仅能够在正常染色体结构和分布的情况下对基因进行检测，还能够检测基因突变、重排等变异情况。

原位杂交的原理
原位杂交是一种核酸杂交技术，通过将标记有荧光物质的探针与待测样品中的靶标序列进行杂交反应来检测和定位特定的DNA或RNA序列。

原位杂交的原理基于两种核酸之间的互补配对原则。

DNA或RNA的互补链能够在一定条件下进行杂交，即互相结合形成
双链。

探针是一段由核酸组成的序列，它与待测样品中的目标序列具有互补的碱基序列。

在原位杂交实验中，首先需要制备探针。

探针可以是由DNA
或RNA构成的，其中至少一部分标记有荧光物质。

荧光物质
的标记使得通过显微镜或其他荧光成像设备能够检测到杂交的信号。

探针与待测样品中的目标序列发生互补配对后，形成探针与目标序列的杂交复合物，即探针与靶标序列互相结合。

为了确保探针与目标序列的特异性结合，一般会在杂交反应中使用一些特异性的条件，如控制杂交温度、盐浓度和pH值等。

此外，还可以使用一些核酸结合蛋白的抑制剂来降低非特异性结合。

通过显微镜观察荧光信号的出现位置和强度，可以确定目标序列在细胞或组织中的位置和数量。

常用的观察方式包括荧光显微镜、原位杂交图像分析系统等。

总的来说，原位杂交利用探针与目标序列的互补配对原理，通
过荧光信号的观察来检测和定位特定的DNA或RNA序列。

这种方法在生物医学研究和分子诊断中具有广泛的应用价值。

原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。

下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。

常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。

2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。

标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。

3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。

4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。

这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。

5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。

6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。

这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。

7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。

评估信号的位置、强度和特异性。

这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。

原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。

原位杂交技术原位杂交技术是一种基因分析技术，可以用来研究细胞内基因的表达模式和基因组的结构。

本文将介绍原位杂交技术的基本原理、应用领域以及未来发展方向。

原位杂交技术最早是在20世纪70年代发展起来的，主要用于研究DNA在细胞中的位置和分布情况。

其基本原理是利用亲和性标记的探针与目标DNA序列特异性结合，通过显色或荧光等方法来检测标记物的位置。

原位杂交技术的具体步骤包括控制组织或细胞的形态、固定样本、渗透处理、杂交、洗脱、显色和观察等。

其中最关键的步骤是杂交反应，需要合理设计探针的序列和标记方法，并进行适当的条件优化。

原位杂交技术广泛应用于生物医学领域，可以用于寻找新的基因、研究基因的表达调控机制、探索基因组的结构与功能等。

例如，科学家可以用这种技术来研究染色体异常、肿瘤基因的异常表达、发育过程中的基因调控等。

此外，原位杂交技术在遗传学、生物学、植物学、动物学和微生物学等领域也有广泛的应用。

在遗传学中，可以用原位杂交技术检测并分离具有特定基因型的个体；在植物学中，可以研究植物的组织分化和发育过程；在动物学中，可以研究胚胎发育和器官再生等。

虽然原位杂交技术在基因研究中起到了重要作用，但仍存在一些局限性和挑战。

首先，该技术的灵敏度和特异性受到探针选择、探针标记和杂交条件等多个因素的影响。

其次，原位杂交技术在细胞外不易实施，因为固定和渗透处理可能会对细胞和组织结构产生破坏。

未来，随着生物技术的不断发展，原位杂交技术也将得到进一步改进和完善。

例如，可以利用新型的标记物和探针来提高技术的敏感度和特异性，同时也可以开发新的杂交方法来降低对样本的破坏。

此外，结合其他高通量分析技术，如转录组学和蛋白质组学，可以更全面地揭示基因表达和调控的网络。

总之，原位杂交技术是一种重要的基因分析技术，可以揭示细胞内基因的表达模式和基因组的结构。

在今后的研究中，我们有理由相信原位杂交技术将发挥更大的作用，并帮助科学家们更好地理解生命的奥秘。

原位杂交技术的具体步骤原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要方法。

它可以帮助我们了解基因在细胞中的定位和表达情况，进而揭示基因调控的机制。

本文将详细介绍原位杂交技术的具体步骤。

一、制备探针在进行原位杂交实验之前，首先需要制备合适的DNA或RNA探针。

探针是一段标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA序列，用于与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。

制备探针的方法有多种，常见的包括随机引物标记法、PCR标记法和转录标记法等。

二、取样和固定在进行原位杂交实验时，需要采集待检测样品，并将其固定在载玻片上。

固定的目的是保持样品的形态结构和细胞核的完整性，以便后续的杂交反应能够准确地进行。

常用的固定方法有冷冻固定、乙醛固定和细胞固定等。

三、脱水和处理在固定完样品后，需要对其进行脱水处理。

脱水的目的是去除样品中的水分，使探针能够更好地与靶标DNA或RNA结合。

脱水处理通常采用浓度递增的乙醇溶液进行，如70%、85%和95%乙醇溶液。

四、杂交反应杂交反应是原位杂交技术的核心步骤。

在杂交反应中，将制备好的探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。

杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液的选择等。

一般来说，杂交温度较高可以提高探针与靶标的互补配对效率，但也可能导致非特异性杂交的发生。

五、洗涤和检测在杂交反应完成后，需要对样品进行洗涤，以去除非特异性杂交的探针。

洗涤的条件通常是选择适当的盐溶液和洗涤时间，以确保只有与靶标DNA或RNA互补配对的探针能够保留在样品中。

洗涤完成后，可以使用适当的检测方法来检测样品中的探针信号，如荧光显微镜、放射自显影等。

六、结果分析根据样品中的探针信号，可以进行结果的分析和解读。

通过观察探针的分布和强度，可以确定靶标DNA或RNA在细胞中的定位和表达情况。

此外，还可以通过对多个样品的比较分析，揭示基因的差异表达和调控机制。

原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以帮助我们研究基因组的结构和功能。

第十三章原位杂交技术原位杂交（in situ hybridization,ISH）是分子生物学、组织化学和细胞学相结合的产物。

该技术是根据核酸碱基互补配对原则，将放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与染色体经过变性的单链DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子。

经过一定的检测手段，可利用显微镜直接观察到所研究的目的序列在细胞或染色体上的位置和分布。

为宏观的细胞学与微观的分子生物学研究架起了一座桥梁，形成了一门新的交叉学科――分子细胞遗传学（molecular cytogenetics）。

原位杂交技术是由Gall 和Pardue利用同位素标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交，于60年代末首次获得成功。

第一节原位杂交基本程序原位杂交的基本程序包括5个基本步骤：第一步是制作用来进行原位杂交的染色体制片，方法与普通染色体制片完全相同。

材料可以是体细胞（如根尖细胞），也可以是花粉母细胞。

以3：1甲醇/乙醇：冰醋酸固定材料，而后做直接压片法或酶解火焰干燥法制片，选择具有理想的细胞分裂时期的片子以备后用。

第二步是对染色体DNA进行变性（denaturation）处理。

先把盖玻片揭开，用RNA酶处理制片，消化掉染色体上的内源RNA，而后用碱、酸或甲酰胺或高温处理，使DNA变性，成为单链状态。

第三步进行杂交。

用以进行杂交的DNA或RNA分子探针通常利用切刻平移法或随机引物标记法标记上放射性的3H、125I或非放射性的生物素（biotin）、地高辛(digoxingenin)。

目前常用的是，把非放射性探针、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鲑鱼精DNA（ssDNA）、磷酸缓冲液（SSC）配成杂交液，置于制片上，盖上盖玻片，在37℃右的温箱中保温过夜，使探针同与其碱基序列具有互补性的单链DNA分子进行充分杂交，形成双链。

而后打开盖片，冲洗掉多余未杂交的探针。

第四步信号检出和对染色体进行染色。

对于使用放射性标记探针的，先将制片浸入一定浓度的感光乳剂溶液，并缓慢取出，使制片表面涂上一层均匀的感光乳剂，而后把制片放入暗箱，进行2－3天的感光，接着进行显影和定影。

原位杂交技术（insituhybridization,ISH）我们常说，科学家也是艺术家，在明确真理探索科学的道路上，往往会创造出很多极具美感的艺术作品，比如下面的这些实验结果图，美吧~---Olson, B. D. and Downes, G. B.---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos所以今天小笔为大家介绍的就是能做出这种美美图的新技能，原位杂交实验~基本原理简单点说就是碱基互补配对原则。

官方来讲的话，就是我们将外源核酸（也就是常说的分子探针）与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对，形成核酸杂交分子，再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。

实验技术的更新是很快的，在明确了该技术的可行性后，科学家进一步改进并进行分类，主要有以下几类：荧光原位杂交技术：DNA分子原位杂交技术；在原技术手段上增加了荧光元素，技术手段较为先进，易掌握，运用广泛，一会儿小编会着重介绍哦~毕竟，能够在我们自己的实验中运用上，才是我们的最终目标嘛。

多彩色荧光原位杂交技术：显而易见，是荧光原位杂交的升级版，采用多个荧光来检测，目前的发展及运用也是较多的。

原位PCR：将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。

说实话，了解的比较少，我就不班门弄斧了，呵呵。

基因组原位杂交技术：该技术在我们的领域可能运用的毕竟少，主要是根据物种DNA同源性差异实现，在农作物等的杂交育种上运用较广，我就不详细介绍啦~明确了以上的分类及原理后，接下来小编主要讲讲在我们的领域中运用较广的荧光原位杂交方法。

结合示意图可以更好的理解哦~实验材料（重要的，基础材料不赘述）1. 4%多聚甲醛（1x PBS配置）：固定剂2. 蛋白激酶K：使得靶核酸暴露，增加探针和靶核酸结合。

3. 杂交缓冲溶液实验步骤取材：动物组织取材（小鼠采用心脏灌流法）后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右， 1x PBS洗5次，每次30分钟，用25%蔗糖脱水过夜（均在4°进行）。

原位杂交技术一、概述（一）概念：原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交( nucleic acid molecular hybridization )的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。

是将分子杂交与组织学相结合的一项技术，也称之为杂交组织化学(hybridization histochemistry)、细胞杂交(cytologicalhybridization)或原位杂交组织化学(in situ hybridizationhistochemistry)。

（二）历史和现状可以检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA序列。

二、原位杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子(DNA , RNA)的碱基对形成氢键的互补性(A=T , A=U , C=G)，用一标记的核酸探针去检测与之碱基互补的靶核酸，这与免疫学中抗原－抗体的反应相似。

优点：①分子杂交的特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。

②既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。

③所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片。

④应用范围广泛，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。

三、探针(probe)是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上。

用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶核酸的探测。

（一）探针种类、来源和应用1. 双链cDNA探针2. 单链cDNA探针3. 寡核苷酸探针4. cRNA探针（二）探针标记的种类1.放射性标记2.非放射性标记最常用的为生物素(光敏生物素、补骨脂素生物素)和地高辛(digxigenin , DIG)，此外还有荧光素、酶类，如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)等。

核酸分子杂交技术分子杂交是利用某些分子与另外的一些分子特异结合而形成结合体的过程，狭义指核酸分子杂交即具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交,液相杂交,原位杂交。

1、固相杂交固相杂交即先将待测单链核酸样品结合到支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交。

固相杂交的特点：固相杂交后，未杂交的游离片段易除去，从而使膜上留下的杂交分子较易检测，并可有效避免靶DNA自我复性。

故固相杂交技术最为常用。

常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

2、液相杂交液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。

液相杂交是研究最早的杂交类型，但应用的普遍程度较固相杂交为低。

液相杂交的特点：无需支持物。

待测核酸分子不用固定在支持物上。

其弊端是由于杂交后过量的未杂交探针存在于溶液中，在已有杂交结合物检测水平条件下检测误差较高。

故液相杂交在过去较少应用。

近年来由于杂交检测技术的不断进步，商业检测试剂盒的开发等液相杂交技术得到了迅速发展。

常用的液相杂交类型有：吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交、复性速率液相分子杂交等。

3、原位分子杂交原位分子杂交实际上是固相杂交中的一种形式，杂交过程中待测DNA处于未经抽提的染色体之上，并在原位置上被变性成单链，与探针进行分子杂交。

原位分子杂交与其他杂交技术主要区别在于待测碱基序列位于染色体上。

其主要特点是可以准确定位目的DNA在染色体上的位置。

因此在分子遗传学研究、癌基因定位、遗传性疾病临床诊断方面具有重要而广泛应用。

下面做下具体介绍：1、菌落原位杂交●基本原理：菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。

原位杂交技术概述探针基本步骤概述核酸的分子结构和特性核酸的化学组成：嘌呤碱和嘧啶碱。

戊糖、磷酸。

DNA的变性和复性DNA变性指DNA二级结构在加热、改变溶液的pH值等，使双螺旋之间的氢键断裂，双螺旋结构解开，形成单链无规则线团。

我们把50％DNA分子解链的温度称为变性温度（Tm）DNA复性变性的DNA在消除变性条件后两条互补链可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation核酸分子杂交技术利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。

核酸分子杂交液相杂交固相杂交吸附杂交菌落原位杂交发光液相杂交斑点杂交法液相夹心杂交Southern印迹杂交复性速率液相杂交Northern印迹杂交组织原位杂交1.原位杂交组织化学技术2原位杂交免疫细胞化学技术（其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。

固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。

）原位杂交组织化学（in situ hybridization histochemistry；ISHH）原位杂交的本质就是使具有特异序列的单链核酸分子通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位。