实验一 培养基的制备

实验一培养基(d e)配制及灭菌培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或积累代谢产物(de)营养基质,用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物.各类微生物对营养(de)要求不尽相同,因而培养基(de)种类繁多.在这些培养基中,就营养物质而言,一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类.培养基(de)配制,一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育(de)需要,二是培养基在使用前不带菌,三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化.培养基(de)灭菌通常在培养基配制后进行,其目(de)是杀灭培养基中残存(de)微生物或活(de)生物残体,保证培养基在贮存过程中不变质,也防止其他生物对培养(de)污染.一、实验目(de)1．掌握实验室常用玻璃器皿(de)清洗、干燥和包扎方法.2．明确培养基(de)配制原理.3．掌握配制培养基(de)一般方法和步骤.4．了解湿热和干热灭菌(de)原理,并掌握有关(de)操作技术.二、实验原理灭菌是指杀灭物体中所有微生物(de)繁殖体和芽孢(de)过程.消毒是指用物理、化学或生物(de)方法杀死病原微生物(de)过程.灭菌(de)原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性,从而达到灭菌(de)作用,实验室中最常用(de)就是干热灭菌和湿热灭菌.干热灭菌是利用高温使微生物细胞内(de)蛋白质凝固变性而达到灭菌(de)目(de).细胞内(de)蛋白质凝固性与其本身(de)含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢.因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高（160～170℃）,时间长（1～2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃.否则,包器皿(de)纸或棉塞就会烧焦,甚至引起燃烧.高压蒸气灭菌是将待灭菌(de)物品放在一个密闭(de)加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间(de)水沸腾而产生蒸气.待水蒸气急剧地将锅内(de)冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸气不能溢出,而增加了灭菌器内(de)压力,从而使沸点增高,得到高于100℃(de)温度.导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌(de)目(de). 在同一温度下,湿热(de)杀菌效力比干热大.其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低,二是湿热(de)穿透力比干热大,三是湿热(de)蒸气有潜热存在.这种潜热,能迅速提高被灭菌物体(de)温度,从而增加灭菌效力.培养基是人工配制(de)适合微生物生长繁殖或积累代谢产物(de)营养基质,用以提供微生物生长发育所需(de)物质条件.培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基,培养放线菌常用高氏I号培养基,培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）,培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基（PDA）.根据培养目(de)不同,可分为固体培养基和液体培养基；此外,还有加富、选择、鉴别等培养基之分.就培养基中(de)营养物质而言,一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类.琼脂（Agar）只是固体培养基(de)支持物,一般不为微生物所利用.它在高温下熔化成液体,而在45℃左右开始凝固成固体.在配制培养基时,根据各类微生物(de)特点,就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要(de)培养基. 培养基除了满足微生物所必需营养物质外,还要求有一定(de)酸碱度和渗透压.霉菌和酵母菌(de)pH偏酸；细菌、放线菌(de)pH为微碱性.所以每次配制培养基时,都要将培养基(de)pH值调到一定(de)范围.常用微生物培养基(de)配方如下：LB培养基配方（pH ）：胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 g酵母提取物（Yeast extract） 5.0 g氯化钠（NaCl） 10.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g摇动容器直至溶质溶解,用5mol/L NaOH调pH至 ,用去离子水定容至1L,在压力下灭菌20min.牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH）：牛肉膏 3.0 g胰蛋白胨（Tryptone） 10.0 gNaCl 5.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mL高氏I号培养基配方（pH ）：可溶性淀粉 20.0 gNaCl 0.5 gKNO31.0 gK 2HPO43H2O 0.5 gMgSO47H2O 0.5 gFeSO47H2O 0.01g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mL马铃薯培养基配方（自然pH）：马铃薯（去皮） 200.0 g葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose） 20.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mL察氏培养基配方（自然pH）：蔗糖（glucose） 30.0 gNaNO32.0 gK 2HPO41.0 gKCl 0.5 gMgSO47H2O 0.5 gFeSO47H2O 0.01 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000 mLYPD培养基配方（pH ）：酵母提取物（Yeast extract） 10.0 g蛋白胨（Peptone） 20.0 g葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose） 20.0 g琼脂粉（Agar） 20.0 g去离子水 1000mL在压力下灭菌20min.三、实验材料牛肉膏蛋白胨、高氏I 号、LB 、PDA 、YPD 、察氏等各种培养基.四、仪器设备及用具1. 90mm 培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH 试纸（pH ～）、记号笔、麻绳、纱布等；2. 培养基分装器、天平、电磁炉、微波炉、电炉、石棉网、电热鼓风干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅.五、试剂无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨（Peptone ）、胰蛋白胨（Tryptone ）、酵母提取物（Yeast extract ）、NaCl 、琼脂粉、5mol/L NaOH 、1mol/L HCl 、KNO 3、K 2HPO 43H 2O 、MgSO 47H 2O 、FeSO 47H 2O 等.六、实验步骤1．洗涤用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗 2～3次；用少量去离子水荡洗 1～2次,控干水分.注意事项：①不能用有腐蚀作用(de)化学试剂,也不能使用比玻璃硬度大(de)物品来擦拭玻璃器皿；新(de)玻璃器皿应用2%(de)盐酸溶液浸泡数小时,用水充分洗干净.②用过(de)器皿应立即洗涤.③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道(de)物质不能直接倒在洗涤槽内,必须到在废物缸内.④洗涤后(de)器皿应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠.2．器皿包扎（1）培养皿：洗净(de)培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起,用牢固(de)纸卷成一筒,或装入特制(de)不锈钢桶中,然后进行灭菌.（2）吸管：洗净,烘干后(de)吸管,在吸口(de)一头塞入少许脱脂棉花,以防在使用时造成污染.塞入(de)棉花量要适宜,多余(de)棉花可用酒精灯火焰烧掉.每支吸管用一条宽约4～5cm(de)纸条,以 30～50℃(de)角度螺旋形卷起来,吸管(de)尖端在头部,另一端用剩余(de)纸条打成一结,以防散开,标上容量,若干支吸管包扎成一束进行灭菌,使用时,从吸管中间拧断纸条,抽出吸管.（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适(de)棉塞,棉塞可起过滤作用,避免空气中(de)微生物进入容器.制作棉塞时,要求棉花紧贴玻璃壁,没有皱纹和缝隙,松紧适宜.过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染.棉塞(de)长度不小于管口直径(de)2倍,约2/3塞进管口.若干支试管用绳扎在一起,在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸,再用绳扎紧.三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎.3．烘干洗净(de)仪器控去水分,放在烘箱内烘干,烘箱温度为 105～110℃烘1小时左右.此法适用于一般仪器.对于急于干燥(de)仪器或不适于放入烘箱(de)较大(de)仪器可用吹干(de)办法.通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分(de)仪器中摇洗,然后用电吹风机吹至完全干燥.不急等用(de)仪器,可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分,然后自然干燥.可用安有木钉(de)架子或带有透气孔(de)玻璃柜放置仪器.4．培养基(de)配置（1）牛肉膏蛋白胨培养基A、称量按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放入烧杯中.牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯,也可按在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片.蛋白胨很易吸湿,在称取时动作要迅速.另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净,擦干,再称取另一药品.瓶盖也不要盖错.B、融化在上述烧杯中先加入少于所需要(de)水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解.将药品完全溶解后,补充水到所需(de)总体积,如果配制固体培养基时,将称好(de)琼脂放入己溶(de)药品中,再加热溶化,最后补足所损失(de)水分.C、调节pH在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基(de)原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达.反之,用1mol/LHCL进行调节.对于有些要求pH较精确(de)微生物,其pH(de)调节可用酸度计进行.pH不要调过头,以避免回调而影响培养基内各离子(de)浓度.配制pH低(de)琼脂培养基时,若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌,则琼脂因水解不能凝固.D、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利某些实验结果(de)观察.一般无特殊要求(de)情况下可以省去（本实验勿需过滤）.E、分装按实验要求,可将配制(de)培养基分装人试管内或三角烧瓶内（见图3-1）.a液体分装：分装高度以试管高度(de)l/4左右为宜.分装三角瓶(de)量则根据需要而定,一般以不超过三角瓶容积(de)一半为宜,如果是用于振荡培养用,则根据通气量(de)要求酌情减图1-1培养基(de)分装A漏斗分装装置；B自动分装装置.1铁架；2漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7装量调节；8开关少；有(de)液体培养基在灭菌后,需要补加一定量(de)其他无菌成分,如抗生素等,则装量一定要准确.b固体分装：分装试管,其装量不超过管高(de)1/5,灭菌后制成斜面.分装三角烧瓶(de)量以不超过三角烧瓶容积(de)一半为宜.c半固体分装：试管一般以试管高度(de)1/3为宜,灭菌后垂直待凝.在分装过程中,应注意不要使培养基沾在管（瓶）口上,以免沾污棉塞而引起污染.F、加塞培养基分装完毕后,在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅胶塞及试管帽等）,棉塞(de)作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基,防止由此而引起(de)污染；另一方面保证有良好(de)通气性能,使培养在里面(de)微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气.因此棉塞质量(de)好坏对实验(de)结果有着很大(de)影响.一只好(de)棉塞,外形应象一只蘑菇,大小、松紧都应适当（见图3-2）.加塞时(de)棉塞(de)总长度(de)3/5应在口内,2/5在口外.图1-2 棉塞(de)制作G 、包扎加塞后,将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期.三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期.（2）高氏I 号培养基配制方法A 、称量和溶化：按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中,并用少量冷水将淀粉调成糊状,再加入少于所需水量(de)沸水中,继续加热,使可溶性淀粉完全溶化.然后再称取其他各成分依次逐一溶化.对微量成分FeSO 47H 2O 可先配成高浓度(de)贮备液按比例换算后再加入,方法是先在100mL 水中加入1g(de)FeSO 47H 2O 配成0.01g/mL,再在1000mL 培养基中加1mL(de)mL(de)贮备液即可.待所有药品完全溶解后,补充水分到所需(de)总体积.如要配制固体培养基,其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法.B 、调pH 、分装、包扎：灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法.（3）LB 培养基配制方法准确称量胰蛋白胨（Tryptone ）10g,酵母提取物（Yeast extract ）5g,氯化钠（NaCl ） 10g 放入一烧杯中,摇动容器直至溶质溶解,加入15～20g 琼脂粉,用5 mol/L NaOH 调pH 至,用去离子水定容至1L,分装,灭菌20min.（4）马铃薯培养基配制（PDA ）取去皮马铃薯200g,切成小块,放入1500mL(de)烧杯中煮沸30min,注意用玻棒搅拌以防糊底.然后用双层纱布过滤,取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖,霉菌用蔗糖）,加热煮沸后加入琼脂,继续加热融化并补足失水.再按前所述,进行分装、加塞、包扎、灭菌20min.（5）察氏培养基配制方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制.（6）YPD培养基配制方法同LB培养基配制.5. 灭菌（1）高压蒸气灭菌A、首先将内层锅取出,再向外层锅内加入适量(de)去离子水,使水面与三角搁架相平为宜.B、放回内层锅,并装入待灭菌物品（各种玻璃器皿、培养基等）.注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果,三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口(de)纸而透人棉塞.C、加盖,并将盖上(de)排气软管插入内层锅(de)排气槽内.再以两两对称(de)方式同时旋紧相对(de)两个螺拴,使螺栓松紧一致,勿使漏气.D、通电加热,并同时打开排气阀,使水沸腾5min,以排除锅内(de)冷空气.待冷空气完全排尽后,关上徘气阀,让锅内(de)温度随蒸气压力增加而逐渐上升.当锅内压力升到所得压力时,控制热源,维持压力至所需时间.E、灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表(de)压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品.（2）干热灭菌A、装入待灭菌物品将包好(de)待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内,关好箱门.B、升温接通电源,拨动开关,打开电烘箱排气孔,旋动恒温调节器至绿灯亮,让温度逐渐上升.当温度升至100℃时,关闭排气孔.在升温过程中,如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内停止加温,此时如果还未达到所需(de)160～170℃温度,则需转动调节器使红灯再亮,如此反复调节,直至达到所需温度.C、恒温当温度升到160～170℃时,借恒温调节器(de)自动控制,保温2h.D、降温切断电源、自然降温.E、开箱取物待电烘箱内温度降到70℃以下后,打开箱门,取出灭菌物品.6. 无菌捡查将灭菌培养基放入37℃(de)温室中培养24～48h,以检查灭菌是否彻底.注意事项：由于纸张和棉花在180℃以上时,容易焦化起火,所以干热灭菌(de)温度切勿超过180℃；由于油纸在高温下会产生油滴,滴到电热丝上易着火,所以进行干热灭菌(de)玻璃器皿严禁用油纸包装；由于温度(de)急剧下降,会使玻璃器皿破裂,所以烘箱(de)温度只有下降到60℃以下,才可打开烘箱门；烘箱内物品不宜放得太多,以免影响空气流通,而使温度计上(de)温度指示不准,造成上面温度达不到,下面温度过高,影响灭菌效果.七、思考题1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要(de)温度高,时间长2. 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么3. 在配制培养基(de)操作过程中应注意些什么问题为什么4. 培养基配好后为什么必须立即灭菌如何检查灭菌后培养基是否无菌5. 你配制(de)高氏I号培养基有沉淀产生吗说明产生或未产生(de)原因.6. 细菌能在高氏I号培养基上生长吗为了分离放线菌,你认为应该采取什么措施。

实验一培养基的制备和灭菌请同学们预习实验讲义，写好预习报告,内容包括实验目的、实验原理、实验操作步骤。

上课时操作可以参考，下课前交给老师。

一. 操作前准备1.各组所需的玻璃器皿(1)小试管：6支（15*150mm）(2)三角瓶：2个（250ml）(3)培养皿：6套（ф9cm）(4)吸管：3支（1ml）(5)三角玻扒：2支2.各组同学配备培养基的工具（1）烧杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml）（2）量筒：1个（100ml）（3）玻棒：1支（4）分液漏斗：1套（5）药匙：2把二. 培养基的配备各组同学先将试管和三角瓶贴好标签。

注明培养基名称，组别，日期。

标签粘贴位置在离瓶口1/3管(瓶)身处。

操作步骤：称量→溶化→定容→调PH→过滤→分装→包扎小烧杯小烧杯量筒大烧杯省略1. 配制营养肉汤培养基150ml将小烧杯或称量纸置天平上，用药匙取按配方称取各种成分放入200ml的烧杯中，用少量蒸馏水溶解然后定容150ml，先配成液体培养基，再按下面方法分装：（1）取100ml装入250ml三角瓶，加入琼脂2g，浸泡于液体培养基里，用棉塞（胶塞）塞好瓶口，贴好标签，再用防潮纸和棉绳将棉塞罩住扎好。

（2）取50ml倒在250ml烧杯里，加入琼脂1g，浸泡于液体培养基里，在电炉上加热融化后，注意补充水分保持体积不变用分液漏斗分装6支小试管，每支5ml左右（约试管高度的1/4左右），用硅胶塞塞好试管口，贴好标签，再用防潮纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。

2.配制麦芽汁培养基（方法同上）配置好的培养基，交到侧边台，让老师登记，待灭菌。

三. 包扎1.培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。

2.试管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。

棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60º角，并将右端多余的报纸打一小结。

实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1. 了解配制培养基的一般方法和步骤;掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基的制备方法。

2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。

二、实验器材1. 药品:牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;葡萄糖(蔗糖);琼脂;1N NaOH;1N HCl等。

2. 仪器及其他:试管;锥形瓶;量杯;玻璃棒;漏斗;纱布;棉花;报纸;天平或台秤;马铃薯;电炉;铝锅;灭菌锅等。

三、实验方法(一)配制培养基的基本过程:(1)称量:按照培养基配方，称取各种原料放于锅中;(2)溶解:锅中加入所需水量(自来水)，加热溶解。

要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分;(3)调pH值:按配方要求调节;(4)过滤:用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。

(5)分装:按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量:斜面培养基装入的培养基约为试管高度的l/5,1/4，灭菌后制成斜面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

(6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。

制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。

也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞(见图)。

棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。

棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。

如制作时不慎沾上培养基则不可再用。

(7)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。

然后用笔注明培养基名称、组别、日期。

培养基的制备与灭菌实验报告培养基的制备与灭菌实验报告引言：在微生物学研究中，培养基是不可或缺的工具。

培养基的制备和灭菌是保证实验结果准确性和可重复性的重要步骤。

本实验旨在探究培养基的制备方法和灭菌技术的应用。

一、培养基的制备1.1 选择合适的培养基成分培养基的成分根据微生物的需求而定。

常见的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。

在制备培养基时，需根据所研究的微生物特性选择合适的成分。

1.2 制备培养基的步骤制备培养基的步骤主要包括称量、溶解、调pH、加热消毒和装瓶。

首先，按照配方称取所需成分，并逐一溶解于适量的蒸馏水中。

随后，根据微生物的需求，调节溶液的pH值。

最后，将溶液装入试管或培养皿中，并加热消毒。

二、灭菌技术的应用2.1 灭菌的目的灭菌是指将培养基、培养器具和实验室环境中的微生物杀灭或去除的过程。

灭菌的目的是为了避免外来微生物的污染，确保实验结果的准确性。

2.2 常用的灭菌方法常用的灭菌方法包括高温灭菌、化学灭菌和紫外线灭菌。

高温灭菌是指将培养基或器具在高温条件下进行加热消毒，常用的方法有烘箱灭菌和压力灭菌。

化学灭菌则是通过使用化学物质如酒精、乙醛等来杀灭微生物。

紫外线灭菌则是利用紫外线的辐射杀灭微生物。

2.3 实验中的灭菌操作在实验中，常用的灭菌操作包括培养基灭菌、器具灭菌和工作台灭菌。

培养基灭菌是将制备好的培养基加热消毒，以杀灭其中的微生物。

器具灭菌则是通过高温、化学物质或紫外线对实验器具进行消毒。

工作台灭菌则是通过紫外线辐射对实验台面进行灭菌处理。

结论：培养基的制备和灭菌是微生物学研究中的重要环节。

正确的培养基制备和灭菌操作可以确保实验结果的准确性和可重复性。

通过本实验，我们学习了培养基的制备方法和常用的灭菌技术，为今后的微生物实验打下了基础。

参考文献：[1] 陈晓玲, 赵莉, 邱晓红, 等. 基础微生物学实验教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2017.[2] 郭燕妮, 张晓红. 微生物学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 2019.。

实验一微生物培养基的制备方法一、培养基(medium)培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求又有很大差异。

目前已使用的各种培养基都是前人经过反复实践，比较设计的成果。

二、培养基的基本成分●能源、碳源：自养微生物以二氧化碳为碳源，光或无机物为能源，在无机物组成的培养基中生长。

例如化能自养型的氧化硫杆菌培养基中，加入粉末状硫为能源，以空气中的CO2为碳源。

异养微生物以有机物为碳源和能源，培养基中常需加入葡萄糖、蔗糖或麦芽糖、乳糖等单糖或双糖，有的可利用淀粉、纤维素等多糖，或利用动物组织中的糖类。

例如培养细菌常用的牛肉膏蛋白胨培养基，其中牛肉膏即为主要碳源和能源。

●氮源：自养微生物以含氮无机物铵盐、硝酸盐等为氮素营养，例如氧化硫杆菌以(NH4)2SO4为氮源；异养微生物以无机物铵盐、硝酸盐或含氮有机物为氮源。

自生固氮菌利用空气中的N2为氮素营养，其培养基中无须加入氮源，称为无氮培养基。

●矿质元素、生长因子：微生物生长繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要矿质元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培养基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、KCl、FeSO4等无机盐类；生长因子主要是调节微生物代谢活动的B族维生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。

许多天然成分的原料如牛肉膏、麦芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各种无机元素和生长因子，不需另外添加。

三、培养基的类型根据原料来源不同，可将培养基分为合成培养基、半合成培养基与天然培养基。

●合成培养基：由化学成分已知的有机物和无机物配制而成。

成分精确，重复性强。

但营养局限，微生物生长缓慢。

适用于菌种分离、选育、遗传分析及生物测定等。

如培养放线菌的高氏培养基、培养霉菌的察氏培养基以及各种化能自养菌培养基等。

●半合成培养基：由某些天然物质与少量已知成分的化学物质配制而成。

实验一培养基的配制与灭菌一、目的学习并掌握培养基配制及灭菌的方法二、原理（一）培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。

培养基通常包括下列成分（表1）表1培养基的组成成分及其作用配制培养基可以直接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。

一般要配下列母液：1、微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成1000×2、有机化合物母液：通常配成100×3、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独配制。

浓度为1000×4、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg到1.0mg/ml不等。

5、10×大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混合配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。

用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。

(二) 培养基的灭菌：培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。

灭菌方法下列几种：1．高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在1210C、108KPa(1.1k g/cm2)的压力下持续约20分钟。

2、过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22μm(或更小)的微孔过滤器装置后，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。

此法用于不能以高温高压灭菌的培养液或酶液的除菌。

3. 60Coγ射线法：用γ射线过量照射以灭菌。

可用于大量灭菌，但设备昂贵。

三、仪器设备及用具(一)仪器设备万分之一电子天平百分之一电子天平超净工作台高压锅酸度计磁力搅拌器及搅拌子不锈钢过滤器玻璃蒸馏水器家用冰箱(二)用具烧杯：100ml×1，500ml×1 ；量筒：100ml×1，250ml×1磨口试剂瓶：100ml×1，500ml×1；带盖试剂瓶：500ml×2三角瓶：100 ml×1，250 ml×1药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干(三)试剂1N HCL 02N KOH 蔗糖（分析纯）琼脂粉N6大量：KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2P O4 (NH4)2SO4B5微量：KI H3BO3MnO4·H2O ZnSO4·7H2O Na2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O CoCL2·6H2O Na2EDTA FeSO4·7H2OB5有机：盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸肌醇谷氨酰胺水解酪蛋白脯氨酸2、4－D 6-BA NAA五、实验步骤（一）配母液1、B5微量元素母液（1000×/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。

培养基的制备与灭菌实验报告实验目的，通过本次实验，掌握培养基的制备方法和灭菌技术，为后续微生物培养实验打下基础。

一、培养基的制备。

1.准备所需试剂和设备，蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、琼脂、蒸馏水、培养皿、量筒、坩埚、移液器等。

2.称取适量蔗糖、蛋白胨、酵母提取物加入蒸馏水中，充分溶解后调节pH值至7.0。

3.加入适量琼脂，搅拌均匀。

4.分装至培养皿中，待凝固后进行灭菌处理。

二、培养基的灭菌。

1.将制备好的培养基装入培养皿中，封口。

2.将培养皿放入高压灭菌锅中，进行高压灭菌处理。

3.灭菌条件，121℃，压力为15psi，持续20分钟。

4.取出培养皿，放置在无菌工作台上待凉，避免细菌再次污染。

5.观察培养基表面是否有凝固不均匀或气泡，如有则说明灭菌不彻底，需重新处理。

三、实验结果。

1.经过灭菌处理的培养基表面平整，无气泡，无明显异物。

2.在无菌条件下打开培养皿，用无菌移液器移取适量微生物菌种接种于培养基表面。

3.将接种好的培养皿放入培养箱中，进行培养观察。

4.培养箱条件，温度控制在37℃，培养时间根据不同微生物而定。

四、实验结论。

本次实验通过制备培养基和灭菌处理，成功培养出微生物菌种，并观察到了微生物的生长情况。

培养基的制备和灭菌是微生物实验中非常重要的步骤，只有保证培养基的无菌，才能得到准确的实验结果。

通过本次实验的学习，相信对于今后的微生物实验有了更深入的认识和理解。

五、实验注意事项。

1.在制备培养基时，需注意称取试剂的准确性和加入顺序。

2.灭菌处理时，要确保培养基充分接受高压蒸汽的灭菌作用。

3.实验操作要在无菌条件下进行，避免外界污染。

4.培养箱的温度和培养时间要根据不同微生物的生长特性进行调整。

六、实验延伸。

在今后的实验中，可以尝试不同种类的培养基制备和灭菌处理，观察其对微生物生长的影响，进一步探索微生物的生长规律和特性。

总之，培养基的制备和灭菌是微生物实验中不可或缺的重要环节，只有掌握了这些基本技能，才能进行准确可靠的微生物实验。

培养基的配制和灭菌实验报告(共8篇) 培养基的制备与灭菌实验报告(详细)一、实验题目：培养基的制备与灭菌二、实验目的：1、明确培养基的配置原则，掌握配置方法。

2、了解灭菌的原理，学习掌握灭菌器的使用方法。

三、实验器材：1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂。

2、仪器：三角瓶、培养皿、试管、线绳、棉花、烧杯、报纸、移液管、试管架、铁针、量筒。

四、实验原理：1、培养基的制备包括一下几种成分：（1）水分：主要成分。

（2）N源：包括无机氮和有机氮。

（3）C源：主要是含碳有机物、碳氢化合物等。

（4）无机盐：如NaCl、KH2PO4等。

微量元素：Cu、K、Mg、S、P、Zn。

有些还需要添加“生长因子”，通常是维生素类、某些氨基酸或核酸等。

2、培养基配置的原则根据不同的培养对象及培养目的，选用不同的培养基，但有机物总量不得超过15%，盐类一般不超过1%。

培养基有以下分类：按成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基按用途：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基培养基配好后应立即灭菌，防止营养物质中的微生物富集。

3、灭菌：用理化手段杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子，在实验中应对所有仪器、操作场所、药品及培养基灭菌或消毒。

（1）高压蒸汽灭菌：将物品放入封闭的加压灭菌器，加热使灭菌锅套间的水沸腾产生蒸汽，将冷空气排尽，压力上升，使水沸点变高，导致菌体蛋白质变性，一般0.1MPa、121℃、15~30min 可以彻底灭菌，本次实验灭菌20min。

若是含糖培养基，110℃、30min。

（2）干热灭菌：微生物细胞内蛋白质因高温而凝固变性。

因高温，所以含水量小，不利于蛋白质受热变性，所以温度高，时间长。

（3）紫外灭菌：诱导胸腺嘧啶二聚体形成抑制DNA复制。

（4）过滤除菌：实验室中用微孔滤膜（孔径一般为0.22μm）。

除病菌需更小。

五、实验步骤：1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备依次准确称取0.5g牛肉粉、1.0g蛋白胨、0.5gNaCl放入烧杯，加入100mL水，用玻璃棒搅匀溶解，移入三角瓶，并加入1.5g琼脂。

实验一培养基的制备一、目的与要求（一）学习制备培养基的基本技术。

（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。

二、原理牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。

牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。

三、材料与仪器（一）试剂牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

(二)其他试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台称。

四、操作步骤（一）称量根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

（二）溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，ZHU一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。

加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。

溶好后，补足所需水分。

（三）调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。

（四）过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。

（五）分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内，分装装置如实验图8所示；分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1．液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。

2．固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。

分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。

3．半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

（六）加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。

实验一培养基的制备和灭菌一、目的要求1 掌握配制培养基的一般方法和步骤。

2 学习高压灭菌锅的操作方法。

二、基本原理乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；由于辐射能使空气中的氧电离成[O]再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成过氧化氢H2O2，O3和H2O2均有杀菌作用。

紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。

三、器材天平，高压蒸汽灭菌锅，电烘箱，1mol/L NaOH,1mol/L HCl，培养皿，试管，吸管，酒精灯，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，接种环，牛角匙，pH试纸(pH5.5—9.0)，棉花，纱布，牛皮纸，记号笔，麻绳。

四、操作步骤1．称量（1）乳糖蛋白胨培养液：10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL（2）细菌培养液：蛋白胨10g/L；酵母5g/L；氯化钠10g/L；加蒸馏水定容至1L。

实验一培养基的配制实验目的1. 明确培养基的配制原理。

2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。

实验内容学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。

实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。

培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。

另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。

在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。

琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。

它在96℃以上熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。

在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。

培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。

霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。

所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。

牛肉膏蛋白胨培养基配方牛肉膏 3.0 g蛋白胨10.0gNaCl 5.0g水1000mLpH 7.4~7.6高氏I号培养基配方可溶性淀粉20gNaCl 0.5gKNO31gK2HPO4·3H2O 0.5gMgSO4·7H2O 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g琼脂15—25g水1000mLpH 7.4~7.6马铃薯培养基配方马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH察氏培养基配方蔗糖30gNaNO32gK2HPO41gKCl 0.5gMgSO4·7H2O 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g琼脂15~25g蒸馏水1000ml自然pHLB培养基：（大肠杆菌用）胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/LNaCl 10g/L琼脂粉15g/L用1moL/L NaOH调节pH枯草芽孢杆菌常用培养基配方：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+15g琼脂实验器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeS04·7H2O，马铃薯，蔗糖等。