19579617_抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性的相关性分析

·论 著·

[收稿日期]2018-12-24;[修回日期]2019-02-22[基金项目]内蒙古自治区科技计划项目(201602100)[作者简介]张川江(1978-),男,重庆开县人,内蒙古自治区精

神卫生中心副主任医师,医学学士,从事精神疾病诊治研究。*通信作者。E-mail:clx001@sohu.com抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性的

相关性分析

张川江,杨培锋,刘荣馨,贺金花,陈丽霞*(内蒙古自治区精神卫生中心抑郁症治疗中心心身科,内蒙古呼和浩特010010)

[摘要] 目的针对抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性进行生物信息学及分子流行病学层面的相关性分析。方法运用生物信息学及分子流行病学的研究方法,先借助相关数据库判定出单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点,运用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增、Westernblot进一步验证结论,并在此基础上进行抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性的差异分析。结果生物信息学方法分析得到2个符合研究要求的SNP位点(rs25531及5-HTTLPR);PCR扩增产物测序后共发现7种基因型(分别为SASA468bp,SASG468bp、100bp,SALA468bp,SALG468bp,LALA468bp,LALG468bp,LGLG468bp),rs25531及5-HTTLPR两倍点等位基因单倍型发现,2个位点共构成4种单倍型(S-A、S-G、L-A、L-G);rs25531及5-HTTLPR基因多态性在不同抑郁等级人群当中的分布差异、两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论rs25531及5-HTTLPR基因多态性与抑郁障碍不具有统计学层面相关性,但具有生物学层面的相关性,其机制有待进一步验证。 [关键词] 抑郁;基因检测;5-羟色胺转运体 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2019.09.022 [中图分类号] R749.42 [文献标志码] B [文章编号] 1007-3205(2019)09-1079-04

抑郁症是一种人群中具有较高流行性的精神疾

病,患者通常表现为诱因不充分的情绪低落,且低落

状态具有一定的持续性[1]。抑郁症的诱发因素广泛

而复杂,而且诱发抑郁症的矛盾大多属于内源性,即

通常外界环境改变的刺激很难对抑郁症患者形成非

常明显的疗效[2]。基因多态性是生物群体中存在两

种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因的现

象,亦称遗传多态性,其本质是基因水平的变异,一

般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要

调节功能的区域[3]。对于个体而言,基因多态性碱

基顺序终生不变,并按孟德尔规律世代相传。疾病

基因多态性与临床表型多样性的联系已受到重视,

如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化,基因型

与表型之间的联系对探索疾病的发生机制、预测疾

病的转归等均具有重要意义[4]。据研究报道,5-羟

色胺转运体SLC6A4基因与多种精神类病理性情

感变化存在相关且不存在明显的人群聚集性[5]。说

明研究结论的外推性已经得到流行病学层面的验证,但其具体作用机制有待进一步探讨。单核苷酸

多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指

基因组DNA中某一特定核苷酸位置发生了转换、

颠倒、缺失和插入等变化而引起的序列多态性,同时

单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点,5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性在精神卫生类疾病的诊断及治疗、致病基因的发现、族群的演化研究等方面起到了重要作用[6-7]。

因此,本研究拟针对抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性进行生物信息学及分子流行病学层面的相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年5月—2018年1月在内蒙古自治区精神卫生中心接受治疗的抑郁症患者203例,男性79例,女性124例,年龄32~54岁,平均(42.08±8.17)岁。本研究采用随机原则进行研

究对象的选取,在告知受试对象研究目的并取得其

同意签字后方进行研究。本研究中所有健康人群(无抑郁)共228例,男性109例,女性119例,年龄30~56岁,平均(43.09±8.02)岁。2组性别、年龄

差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 抑郁症判定标准和剔除标准 抑郁症的判定标准采用专门的《抑郁自评量表》[8],该量表包含20·9701·第40卷第9期2019年9月 河北医科大学学报JOURNALOFHEBEIMEDICALUNIVERSITY Vol.40 No.9 Sept. 2019

Copyright©博看网. All Rights Reserved. 个条目,按照中国常模结果,该量表标准分的分界值

为53分,其中53~62分判定为轻度抑郁,63~72分

判定为中度抑郁,72分以上判定为重度抑郁。如下

情况的受试者需剔除:①存在交流障碍;②有吸毒

史;③1年内接受过同类型研究。最终纳入有效研

究对象203例。

本研究经医院医学伦理委员会批准。1.3 研究方法1.3.1 查询 利用NCBI中的Gene获得已有文献

报道的抑郁情感障碍人群SLC6A4基因所有的SNP位点;再利用人类基因组数据库ENSEMBLE,

获得大众人群SLC6A4基因所有的SNP位点。SLC6A4统计学分析:对所得的人群和大众人群的SLC6A4所有SNP位点进行归类统计和特征分析。1.3.2 SLC6A4同源基因的序列比对与进化树分析 ①同源基因获取:利用NCBI中的HomoloGene

数据库可查询得到。②同源基因的序列比对:将获

取的物种序列文件导入BioEdit软件,利用其附带

的ClustaW多重序列比对工具,进行同源基因比

对。③进化树分析:利用之前BioEdit比对好的序

列,运用MEGA软件,选择最大似然法则,构建系

统发生树,进化分析结果可显示出人类SLC6A4基

因与其他物种的同源关系强度。1.3.3 SNP与抑郁情感障碍相关潜在位点分析

①筛选SNP位点:第一步,根据突变发生类型,初筛

人群中SLC6A4基因所有的SNP位点,得到发生非

同义突变的SNP位点;第二步,根据突变对蛋白质

结构功能的影响,筛选大众人群中SLC6A4基因所

有的SNP位点,得到对蛋白质结构功能造成破坏的SNP位点;第三步,结合2次筛选结果,得到对蛋白

质结构功能造成破坏的SNP位点。②找寻保守氨

基酸:在同源基因序列比对的结果中,比较从斑马鱼(数据库中记录的最低等生物)到人类的SLC6A4

蛋白序列,确定氨基酸种类保持不变的序列位置,从

而到保守氨基酸(保守氨基酸,是指在物种进化过程

中,该蛋白序列某位置上的氨基酸种类保持不变,即

保守性为100%)。③对比分析:结合得到的保守氨

基酸序列,在筛选出的SNP位点中找寻相应的突变

点,最终获得关键的SNP位点。1.3.4 分子流行病学验证方法 聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增:取患者空腹静脉血10mL,3000r/min离心取上清,等量分装

为4份于-20℃低温环境下保存以供不同检测所

需。用20μLTE缓冲液溶解后采用PCR法检测标

本中mRNA的存在。PCR反应具体条件:根据NCBI中Genbank库的相关基因序列生物信息学数

据设计引物,由上海其明生物有限公司合成。上游

引物序列为:5'-GTTCAGGTAGCGATGAGCTA-

GCAAC-3';下游引物序列为:5'-CTGCATGCA-

GTGAGCAGAGAGCGTC-3';引物长度592bp;反

应温度:95℃,60s/55℃,30s/75℃,60s,持续40

个循环后于75℃条件下延伸10min。试剂盒中所

提供探针均为SLC6A4基因突变探针与内参基因

探针2种荧光探针的混合物,每个反应中检测通道

设置按说明书进行。Westernblot验证:扩增产物采用Western

blot法进行蛋白产物的定性和定量分析。具体步

骤:①将电泳后的凝胶从玻璃板上剥脱下来,置于煮

胶盒,加入25%乙醇至乙醇浸过凝胶面为止,将煮

胶盒放入微波炉,高温煮沸2.5min,重复该步骤3

次;②加入考马斯亮蓝染色液(至染色液浸过凝胶面

为止)浸泡凝胶,放室温摇床缓慢振荡,均匀染色30

min至凝胶上的条带清晰可见;③用双蒸水漂洗已

染色的凝胶后,加入5%的醋酸与25%乙醇混合液,

脱色摇床缓慢摇动1h左右至染色液基本洗脱为

止;④脱色完毕后,将凝胶用双蒸水冲洗,置于凝胶

图像扫描分析仪上观察结果,经图像软件处理后拍

照保存。1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析

数据。计数资料比较采用χ2检验;采用Hardy-

Weinberg平衡检验结果判定样本的群体代表性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因型分析 按照生物信息学方法分析得到2

个符合研究要求的SNP位点,分别为rs25531及5-

HTTLPR,PCR扩增产物测序后共发现7种基因型,

分别为SASA468bp,SASG468bp、100bp,SALA468bp,

SALG468bp,LALA468bp,LALG468bp,LGLG468bp,

见表1。

rs25531及5-HTTLPR的Westernblot结果

见图1。·0801·河北医科大学学报 第40卷 第9期

Copyright©博看网. All Rights Reserved. 表1 rs25531及5-HTTLPR两倍点单倍型分布(例数)

组别例数SASASASGSALASALGLALALALGLGLG无抑郁 2282081321121轻度抑郁6452131511中度抑郁6757201412重度抑郁7263012510χ2值17.563P值0.485

图1 rs25531及5-HTTLPR的Westernblot结果1.DNAMarker;2.SASA;3.SASG;4.SALA;5.SALG;6.LALA;7.LALG;8.LGLG2.2 rs25531及5-HTTLPR两倍点单倍型分布

分析rs25531及5-HTTLPR两倍点等位基因单倍

型发现,2个位点共构成4种单倍型(S-A、S-G、L-A、L-G),两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组

之间的差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.3 各组在rs25531及5-HTTLPR位点的基因型

和等位基因分布 rs25531和5-HTTLPR位点上

基因型和等位基因在不同抑郁等级人群当中的分布

差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。

表2 rs25531及5-HTTLPR两倍点单倍型分布情况

组别例数S-AS-GL-AL-G

无抑郁 2284221276轻度抑郁641091144中度抑郁67117296重度抑郁721290123χ2值14.458P值0.107

表3 各组rs25531及5-HTTLPR位点上基因型和等位基因分布

组别例数s25531基因型GAGGAAs25531等位基因GA5-HTTLPR基因型SLLLSS5-HTTLPR等位基因SL无抑郁 2286202024641051920441343轻度抑郁64175615113175611313中度抑郁67275816118185811717重度抑郁72486020124396012321χ21值=2.765 χ22值=1.396 χ23值=6.525χ21值=3.073 χ22值=2.020 χ23值=3.440P1值=0.838 P2值=0.707 P3值=0.089P1值=0.800 P2值=0.568 P3值=0.329