牛结核病PPD(国家标准品)不同剂量的比较

奶牛结核病的PPD检测技术作者：费强来源：《科学种养》2013年第10期奶牛结核病是由结核分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病，以病牛消瘦、咳嗽、体虚乏力、精神委顿等为特征，患病奶牛痰液、粪尿、乳汁和生殖道分泌物中都可带菌，通过呼吸道与消化道传染传播。

奶牛结核病不但影响畜牧业的持续稳定发展，而且影响着人类的身体健康和社会公共安全，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，我国政府将其列为二类动物疫病。

结核菌素试验（PPD）是奶牛结核病的传统检测方法，其检出率和准确性都比较高，在结核病的诊断和防制过程中发挥着重要作用，很多国家利用该方法消灭和控制了牛结核病，该方法也是世界动物卫生组织推荐的诊断牛结核病的惟一方法。

在实践中，为了防止因误诊而造成的不必要的经济损失，减少工作的重复性，笔者根据多年经验将奶牛结核病的PPD检测技术介绍如下，与广大同仁一起探讨。

一、检测前的准备工作1. 制作检测表格登记表能使检测工作简单明了，奶牛结核病的检测表格内容包括养殖场名称、责任人、奶牛品种、存栏量、日龄、耳标号、检测时间、初始皮厚、72小时或96小时后皮厚、检测人、结核菌素生产厂家、批号等。

2. 拟定检测计划摸清所需检测奶牛数量，准备好足量的牛提纯结核菌素、灭菌生理盐水、一次性注射器、口罩、防护服、手套、相应的人力，让检测工作有序进行。

3. 培训技术员为了减少工作的盲目性，保证检测有条不紊地进行，必须对技术员进行培训，内容包括自身安全防护、剃毛、注射方法、游标卡尺的使用、结果观察等，并对技术员合理分工。

二、操作方法1. 奶牛保定奶牛与外界生人接触较少，有的脾气比较暴躁，最好由该场饲养员协助牵拉保定，不用保定栏，以缩短检测时间，脾气太暴躁者可借助专用保定栏或圈舍以及鼻钳保定。

2. 颈部剃毛术部直径约10厘米，无明显病变。

很多兽医工作人员习惯用剪刀剪毛，这种方式不仅速度慢，而且不能干净剪去毛脚。

如果改用剃须刀，其优势是刮毛干净，测量皮厚准确，注射结核菌素时非常方便快捷。

牛结核病是由牛结核分枝杆菌引起的人、畜和禽共患的一种慢性传染病，人结核的10％以上由牛分枝杆菌引起。

世界各国对结核病大多采取检疫净化的方法进行控制，皮内变态反应是世界动物卫生组织（OIE）唯一指定的检疫方法，其判断标准有三种：1、我国的国家标准注射方法：不论牛只大小，一律皮内注射0.1mL（20000 IU/ mL）的牛型提纯结核菌素，72h 后观察结果。

阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm 。

疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0 mm，同时小于4.0 mm ；阴性反应：无炎性反应，皮厚差在2.0 mm以下。

2、欧盟的对比PPD试验在注射牛型提纯结核菌素（注射方法、剂量同我国的标准）的同时，在牛的颈部另一侧对应部位（或在颈部同一侧，但两次注射的位置间隔大约为12～15cm），皮内注射禽型PPD（20000 IU/ mL） 0.1 mL，72h后观察结果。

阳性反应：牛型PPD反应阳性，且比禽型PPD反应大4mm以上；疑似反应：牛型PPD反应是阳性，并且牛型PPD反应仅比禽型PPD反应多1～4mm；阴性：牛型PPD反应是阳性或阴性，但其反应等于或小于禽反应。

3、世界动物卫生组织（OIE）判断标准仅用牛性结核菌素进行检疫，方法同中国国标，但判断标准较严：局部出现炎性反应，皮厚差≥2.0mm，判断为阳性；皮厚差<2.0mm判断为阴性。

综合来看，世界动物卫生组织（OIE）在牛结核变态反应判定标准较为严格。

欧盟比较法皮内变态反应是对传统的牛型PPD法的改进，能够区别被检动物是由牛型分枝杆菌感染还是由其它非典型分枝杆菌感染，可避免由于禽结核分支杆菌引起的非特异性反应，减少无害化处理损失，对于我国的奶牛结核病检疫净化具有一定的借鉴作用。

奶牛结核病检测方法奶牛结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可以影响奶牛的健康和生产能力，还可以通过食用患有结核病奶牛的牛奶和肉类传播给人类。

因此，对奶牛结核病进行及早的检测和防控非常重要。

下面将介绍几种常用的奶牛结核病检测方法。

一、皮内试验皮内试验是目前最常用和经济实用的奶牛结核病检测方法之一。

这种方法通过在奶牛的皮肤下注射结核菌抗原，观察注射部位是否产生特异性的变应反应来判断奶牛是否感染结核菌。

结果的判断是根据注射后48~72小时观察注射部位是否有明显的硬结和红肿，硬结直径大于10mm者为阳性反应，表明该奶牛可能感染有结核菌。

需要注意的是，皮内试验属于间接试验，存在一定的假阴性和假阳性的可能性，因此在实际应用中需要与其他检测方法相结合来判断奶牛结核病的感染情况。

二、血清学检测血清学检测是通过检测奶牛血液中特异性抗体的存在来诊断奶牛结核病。

常用的血清检测方法包括血液凝集试验、酶联免疫吸附试验和胶体金试验等。

这些方法的原理是将感染结核菌的奶牛的血清与结核菌抗原进行反应，然后通过不同的检测方法观察血清的凝集、发色等反应，判断是否存在结核菌的感染。

相比于皮内试验，血清学检测方法具有操作简单、准确性高等优点，但也存在着一定的假阳性和假阴性的可能性，因此也需要与其他方法相结合来判断奶牛结核病的感染情况。

三、结核菌培养结核菌培养是通过在适当的培养基中培养样本中的结核菌，然后观察菌落的生长情况和形态特征来判断奶牛是否感染结核菌。

这种方法是目前诊断结核病的“金标准”，对确定结核病感染的确诊具有重要意义。

但是，结核菌培养的过程需要较长时间，通常需要培养4-6周才能得到结果，因此不太适合作为常规的奶牛结核病筛查方法。

此外，结核菌培养的操作较为复杂，需要较高的实验室技术和设备条件。

四、核酸检测核酸检测是通过检测奶牛体内结核菌的核酸（基因）来判断是否感染结核菌。

这种方法的优点是操作简便、结果快速，对于早期结核病感染的检测具有较高的灵敏度和特异性。

牛结核病主要是由牛型结核分支杆菌引起的一种人畜共患、慢性、消耗性传染病，病原菌可通过空气、接触或牛奶感染人畜，严重威胁着动物和人类健康[1]。

牛结核病的监测和净化在活畜上需要依赖快速、敏感、特异性强的诊断方法。

目前广泛应用的诊断方法主要包括结核菌素皮内变态反应（TST）、欧盟皮内比较变态反应试验（SICTT）和牛γ干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）。

TST作为OIE指定法定检疫方法，优点是敏感性高，但操作费时费力，特异性差，容易出现假阳性或早期感染易漏检[2-3]。

SICTT是TST方法的改进，可排除检疫中禽结核干扰导致的非特异性变态反应的影响，以避免不必要的淘汰和损失，目前欧盟等国普遍作为活畜检疫确认试验[4]。

IFN-γ-ELISA检测试剂盒是外周血γ-干扰素体外释放检测法在实际中的应用，操作简单、敏感性和特异性高，目前已经得到全世界的广泛认可[5]。

本研究同时采用以上3种方法对河北省石家庄市栾城县某奶牛场进行平行检测，比较不同检疫方法对奶牛结核病阳性率的影响，为今后检疫和奶牛结核病的净化提供技术支撑。

1材料与方法1.1材料1）试验奶牛。

中国荷斯坦奶牛300头，试验奶牛外观健康，无任何结核病临床症状，统一TMR饲喂，自由饮水。

2）主要试剂。

牛型提纯结核菌素（牛PPD，青岛瑞尔生物技术有限公司，批号：P201906-001）；禽型结核菌素（禽PPD，青岛瑞尔生物技术有限公司，批号：P201906-001）；牛结核分枝杆菌IFN-γ检测试剂盒（青岛瑞尔生物技术有限公司，批号：P201906-001）。

3）器材。

剃毛刀、注射器、游标卡尺、酶标仪，CO2培养箱、细胞培养板、肝素钠采血管、移液器、枪奶牛结核病不同检疫方法比较路广计1王晓芳2*马宏伟1张涛3范京慧4刘天驹1轩秋燕1范葶莉5邵丽玮2程丽华6边青岩61.河北省动物疫病预防控制中心，石家庄050000；2.河北省畜牧兽医研究所，河北保定071000；3.河北省石家庄市动物疫病预防控制中心，石家庄050000；4.河北农业大学，河北保定071000；5.沧州职业技术学院，河北沧州061000；6.河北省饶阳县农业农村局，河北饶阳053900摘要采用牛结核菌素皮内变态反应试验（TST）、欧盟比较变态反应试验（SICTT）和牛结核γ干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）对河北省石家庄市栾城县某奶牛场300头奶牛进行结核病平行检测，比较不同检疫方法对奶牛结核病诊断结果的影响，并分析对比检测结果。

奶牛结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
一、范围：
诞生后20天的牛即可用本试验进行检疫。

二、操作方法：
1.注射部位及术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛（或提前一天剃毛），三个月以内的犊牛，也可在肩胛部进行，直径约10厘米。

用卡尺测量术部中心皮皱厚度，作好纪录。

留意，术部应无明显的病变。

2.注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射0.1毫升（含200OlU）O即将牛型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2万IU后，皮内注射0.1亳升。

冻干PPD稀释后当天用完。

3.注射方法：先以75%酒精消毒术部，然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPD,注射后局部应消失小疱，如对注射有疑问时，应另选15厘米以外的部位或对侧重作。

4.注射次数和观看反应：皮内注射后经72小时判定，认真观看局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好具体纪录。

对疑似反应牛应马上在另∙•侧以同一批 PPD同一剂量进行其次回皮内注射，再经72小时观看反应结果。

对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96小时和120小时再分别观看一次，以防个别牛消失较晚的迟发型变态反应。

三、结果判定：
1.阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0亳米。

2.疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0亳米、小于4.0亳米。

3.阴性反应：无炎性反应。

皮厚差在2.0亳米以下。

凡判定疑似反应的牛只，于第一次检疫60天后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经 60天再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。

牛结核病的诊断方法作者：隗金玲来源：《现代畜牧科技》 2016年第9期隗金玲（黑龙江省宾县畜牧兽医局，黑龙江哈尔滨150400）摘要：牛结核的诊断有临床诊断、血清学诊断、细菌学诊断和变态反应诊断等方法，其中最有实际意义的是变态反应诊断。

至于临床和细菌学诊断只对少数有明显症状的牛才有一定的诊断价值，血清学方法目前对结核病的诊断意义不大，很少应用。

本文对几种常用的诊断方法进行简要介绍，以供参考。

关键词：牛；结核病；诊断中图分类号：S858. 23文献标识码：B文章编号：2095-9737(2016)09-0124-011 临床诊断结核病畜多数不呈现明显症状，对于这种隐性的结核病是不易诊断的，在结核病的防治中占有特别重要的位置，所以必须仔细地进行流行病学调查和临床观察。

体表淋巴结剧烈肿大时，则可能为全身性结核；乳房淋巴结肿大或乳房后两个乳腺区发生境界不明的无痛无热的硬结，表面凹凸不平或乳头萎缩，可能感染乳房结核；胸部叩诊呈现实音或半实音，并有杂音、摩擦音，以及直肠检查发现体壁腹膜有密发的珍珠样结节时，可能是感染浆膜结核；阴道流出混浊的黏液，其中混有白色或黄色浮游物甚至血丝，常配不孕，发情不正常，流产以及输卵管变硬时，可能是感染生殖器官的结核；如果发生消化障碍，习惯性腹痛，慢性腹泻与便秘交替或粪便稀薄，混有黏液、脓汁或血汁，以及直肠检查触知肠系膜淋巴结肿大时，可能是感染肠结核。

2 细菌学诊断对确定开放性结核病特别重要。

对可疑为开放性肺结核进行细菌学诊断时，可用棉拭子采取气管黏液或用病牛喷出的干痰块涂片作抗酸性染色进行细菌检查，必要时制成乳剂进行动物接种试验。

病畜常吞咽从肺内咳出的痰汁，细菌即可经过胃肠随着粪便而排出体外。

因此通过粪便也可以检出开放性结核病畜。

①硫酸法：在痰液内加2倍量的6%的硫酸溶液后远心沉淀20min，用3%的苛性钠溶液1～2滴将沉淀物中和。

②安替佛尼法：病料内加2倍量的安替佛尼液，放置温箱1—2h后远心沉淀，用3%醋酸溶液中和沉淀物或用蒸馏水洗涤几次即可，处理后的痰液可作动物接种。

牛结核病是牛感染结核分枝杆菌导致的一种慢性人畜共患传染病，主要表现为渐进性消瘦，引发多器官出现结核结节、干酪样坏死、空洞或钙化，对牛健康生长及养牛业的发展造成巨大影响，因此，必须要重视牛结核病的防治工作。

1病原结核分枝杆菌是引发牛结核病的主要病原，其形态为中等大小，比较纤细，没有芽孢与荚膜和鞭毛。

人型结核分枝杆菌有分枝且细长，牛型结核分枝杆菌比较短粗，禽型结核分枝杆菌小而短具有多形性。

革兰氏染色阳性，具有抗酸性染色特点。

具有抵抗干燥与消毒能力，可利用石炭酸或3%的甲醛消毒。

2流行特点结核病呈隐性传染，流行过程较慢，不仅感染动物，同时还会传播人类，病畜或病人是主要的传染源。

污染的空气、饮水及各种用具、饲料等都可传染牛结核病，消化道和呼吸道是主要的传播途径，还可经交配传播。

3发病症状结核病的潜伏期长短不一，通常为10~15d，有的可超过数月以上。

发病具有隐蔽性，特别是健康状况和精神状况不佳时发病严重，表现渐进性消瘦。

牛感染结核病常常表现为肺部症状，食欲明显下降，同时伴有咳嗽、呼吸困难，被毛失去粗乱无光泽，乳房发生结核后，泌乳明显减少，并有肿块形成，严重者导致乳腺萎缩或肿大变硬，没有发热和疼痛。

肠结核有的表现为腹泻，有的为便秘，食欲下降，明显消化不良，消瘦。

淋巴发生结核时肿胀明显，生殖器官结核会出现明显的性机能紊乱，或减退或亢进，母牛不易受孕，公牛睾丸明显肿大，阴茎结节溃烂。

脑结核有明显的癫痫症状，运动失调，粟粒性结核会遍布全身，检查直肠可以发现腹膜结核。

另外还有皮肤结核和骨结核等。

4剖检结核结节是主要的病变特征，大小不一，有的为针头大，有的为鸡蛋大，颜色有的为黄色，有的为白色，将结核结节切开，内有干酪样坏死物，有的还出现钙化。

增生性结节，黄色或白色干酪样坏死分布于中间部位，有钙化，肉芽组织将其外部包绕。

渗出性的结核结节，渗出浸润组织呈纤维素性，表现为干酪样坏死，斑纹呈灰白色或灰红色分布于切面上。

肺部结核病灶具有干酪样变性，或引发肺内空洞，其中有脓样和干酪样内容物，具有心包炎以及胸膜炎。

牛结核病PPD（国家标准品）不同剂量的比较结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病。

人感染结核病后，常呈慢性经过，并可累及全身各个器官和系统并造成死亡，其中肺脏是最常见的患病部位，约占结核病发病总数的80-90%。

世界上每年约有200-300万人因结核病死亡，我国是结核病流行严重的国家，结核病患病人数仅次于印度居世界第二位，每年因结核病死亡人数达13万，超过其他传染病死亡人数的总和。

结核杆菌主要分牛型、人型和禽型三型，这三种分枝杆菌均可感染人和动物，但以牛型和人型分枝杆菌的致病力较强，除人的结核病患者外，牛是结核病的主要传染源。

因此，控制牛结核病是防控结核病的重要环节。

目前，国际上普遍采用动物结核病的检测方法是牛提纯结核菌素皮内变态反应试验（PPD试验）。

这一方法对牛结核病的检出率很高，并可检出隐性感染牛，但也存在着非特异性反应较高的现象。

为检验PPD剂量对牛结核PPD试验结果的影响，我们于2011年秋季利用中国兽药监察所生产的牛结核PPD国家标准品进行了一次不同剂量的比较试验，现将相关结果报告如下：1.材料与方法1.1 材料1.1.1 在同一牛场内取4头普通PPD试剂皮内变态反应阳性和1头可疑牛作为本次试验用牛。

1.1.2牛结核PPD国家标准品由中国兽药监察所提供。

批号：1.1.3牛结核PPD普通试剂由哈药集团生物疫苗有限公司提供。

批号：1.2方法1.2.1将牛结核PPD国家标准品按1000IU、2000IU和5000IU分组进行稀释。

1.2.2在对牛场整群牛只按GB/T18645-2002的操作要求，应用牛结核PPD普通试剂进行检验，并经72h判定后，选取5头牛（4头阳性、1头可疑）立即进行本次试验。

1.2.3由同一检验员按GB/T18645-2002动物结核病诊断技术的标准进行操作，每头牛选取右侧颈部前后二点和左侧离原检验位置15厘米处选取一点，剪毛、消毒、测量原皮厚并作好记录后，按照右侧前点1000IU、2右侧后点2000IU和左侧相邻点5000IU的顺序注射菌素。