HPLC通用分析方法

hplc原理及操作高效液相色谱分析法(HPLC）是一种以溶剂梯度对样品进行分离和测定的方法。

系一种以压力作为体系内物质运动活动的发动力，以色谱柱为分离器件，以固定及或变量流速溶液作为流动介质的技术。

HPLC的工作原理：样品以溶剂梯度的方式从高压柱头处潜入并向柱底流动，溶质在～20MPa的高压力下正常行驶。

溶质有一定的分馏程度，有分子大小及分子形状的分离和鉴定，其中含有高度纯化的物质结构体，具有极高的灵敏度和准确性，因此常用于检测化学品、药物、农药、食品等样品。

结合柱色谱技术进行分离分析，以溶剂分馏样品中多种物质，基于它们在色谱柱中的不同以及相同的拖动力，从而实现分离和测定。

被分离的分子是从色谱柱进入注入支路的溶质的部分种类，当经过偏光器后，各种物质会被它们所产生的信号鉴定出来，这样就实现找出溶质的分子类型，同时还测定它们出现的百分比以及分析速度等工作。

HPLC仪器由4个基本构成部分：检测器、泵系统、色谱柱和控制系统组成。

1. 检测器：配合色谱柱，根据每个溶质所产生信号进行检测；2. 泵：将溶剂柱体内的样品系流动；3. 色谱柱：负责充当样品分离器；4. 控制系统：控制泵的运转，优化溶剂梯度；并计算并显示每个溶质的信号强度及分离程度等。

HPLC操作：1. 把样品溶于洗涤液中，常用的洗涤液为醇型或水型溶剂。

2. 向色谱柱中倒入洗涤液，使用含具有良好紫外将固定流出，色谱柱中的柱管把不同溶质分开，当柱管中的溶质流出到气体室后，可以改变溶质流量，调节溶质含量或检查特定溶质含量。

3. 启动泵，通过泵向色谱柱内加入溶剂，洗洗涤液渗入样品柱体，梯度洗液流动在柱体内，也可以用不同比例的液体梯度来分离多种溶质；4. 启动检测器，可以看到溶质的表象，根据每个溶质产生信号的特征及强度，确定物质含量以及分析速度等参数，最终得出相应结果；5. 用计算机系统分析数据，根据植测所需，进行图象与数据处理，以及报告和图表的生成等。

HPLC分析法是一种表征分子大小及它们的特征的分离技术，是一种灵敏、用于样品分析的高精度的技术手段。

高效液相色谱仪的原理及应用
高效液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析仪器，根据物质在固定相和流动相
间的相互作用差异来实现物质分离和测定的方法。

高效液相色谱的主要原理如下：
1. 样品进样：样品通过进样器注入到流动相中。

2. 流动相泵：流动相泵将流动相以一定的压力送入进样阀。

3. 进样阀：进样阀控制样品的进入量，并通过连接固定相柱。

4. 固定相柱：固定相在柱中，对流动相和待分离的样品进行分离。

5. 检测器：根据样品的特性和分离程度选择合适的检测器进行检测。

6. 数据处理器：将检测的信号转化为柱温度、流量和检测器信号等数据。

高效液相色谱仪的主要应用包括：
1. 分析化学：用于定性和定量分析化学样品中的成分。

2. 生物化学：用于分析蛋白质、核酸、多肽等生物大分子。

3. 药学：用于分析药物中的活性成分、控制药品的质量。

4. 环境分析：用于监测环境中的有机污染物和无机物质。

5. 食品分析：用于检测食品中的添加剂、残留农药和毒性物质。

高效液相色谱仪的优点包括分离效率高、分析速度快、样品容量小、样品制备简单等。

然而，高效液相色谱仪的操作要求严格，仪器费用较高，且需要使用高纯度的溶剂和试剂。

第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。

HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。

具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。

HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。

目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。

将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。

C18（ODS）是最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。

经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。

它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。

HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。

高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。

经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。

新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。

高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。

近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。

（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。

（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。

（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。

如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。

（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。

（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。

HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的化学分析方法，用于分离、检测有机
和无机物质。

以下是HPLC的一般测定方法：
1. 准备样品和标准品：将待测样品和标准品进行处理，以便与固定相或流
动相分离，同时准备溶剂、试剂等。

2. 选择合适的色谱柱：根据待测物质的性质和分离要求，选择合适的色谱柱。

3. 确定流动相：流动相是HPLC中的重要组成部分，用于将样品中的各组分
带入色谱柱进行分离。

根据待测物质的性质和分离要求，选择合适的流动相。

4. 设置流速：流速是HPLC中一个重要的参数，它影响分离效果和运行时间。

根据待测物质的性质和分离要求，设置合适的流速。

5. 确定检测波长：根据待测物质的性质和检测器类型，选择合适的检测波长。

6. 运行样品：将待测样品通过进样针注入进样阀，然后通过流动相带入色
谱柱进行分离。

在分离过程中，不同组分会在不同的时间流出色谱柱，并被检测器检测到。

7. 记录数据：在分离过程中，检测器会不断检测各个组分的浓度或信号，
并将数据记录下来。

8. 分析数据：根据记录的数据，可以对各个组分进行定性和定量分析。

以上是HPLC的一般测定方法，具体操作可能会因不同的仪器、试剂和样品而有所不同。

在进行HPLC测定时，建议参考相关的操作手册和文献，以确保实验的准确性和可靠性。

液相色谱仪HPLC分析方法验证液相色谱解决方案为了保证分析检测结果精准、牢靠，必需对所接受的分析方法的精准性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。

从本质上讲，方法验证就是依据检测项目的要求，预先设置确定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所接受的分析方法符合检测项目的要求。

方法验证在质量掌控上有紧要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是订立质量标准的基础。

方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、精准度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。

1.专属性专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。

对于纯度检测，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。

必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。

一般要求产品和杂质之间的分别度大于2.0、2.线性线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原材料或产品的浓度呈线性关系的程度。

线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。

一般用储备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用zui小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。

3.范围范围指在能够达到确定的精准度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。

简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度zui大值和zui小值。

需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80%～120%。

4.精准度精准度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证精准度。

精准度应在规定的范围内建立，对于原材料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原材料药进行测定，必要时可与另一个已建立精准度的方法比较结果。