赖氨酸生产菌某些特性及发酵试验的研究

发酵科技通讯第42卷赖氨酸发酵研究进展王欣许宏贤段钢(杰能科(中国)生物工程有限公司江苏无锡214028)摘要：赖氨酸是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸，目前主要用发酵法生产。

本文从发酵培养基、培养条件和工艺优化等方面阐述了微生物生产赖氨酸的研究进展。

关键词：赖氨酸发酵营养因子溶氧建模赖氨酸是人和动物自身不能合成的一种氨基酸必须从外界摄取，而植物中所含的赖氨酸很少，被称为植物中第一限制性氨基酸。

赖氨酸是目前全球使用量最大的氨基酸类饲料添加剂，约90％的赖氨酸被用作饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，其余5％用作医药中间体I”。

L一赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，后来又出现了化学合成法和酶法，但是化学合成法使用己内酰胺和环己烯等剧毒原料，存在严重的环保问题，而酶法也存在酶活不稳定，规模小和成本高的缺点。

直到1960年H本采用微生物直接发酵生产赖氨酸获得成功，才真正推动了赖氨酸生产的研究开发，直接发酵法是目前广泛采用的赖氨酸生产方法。

目前国内主要用发酵法生产赖氨酸的企业有长春大成集团、聊城希杰、宁夏伊品、山东金玉米、安徽丰原生化等[21，其中长春大成集团的赖氨酸生产能力已经居于世界首位。

国外生产赖氨酸的企业主要有日本味之素株式会社、日本协和发酵工业株式会社、美国A D M公司、韩国希杰公司和德国巴斯夫公司。

工业生产中最高产酸率已经提高到1809／L，提取收率也达到90％左右。

直接发酵法生产赖氨酸的主要微生物有棒状杆菌、短杆菌、念球菌、诺卡氏菌、埃希氏菌、假单胞菌、芽孢杆菌、加斯酵母等。

目前国内外用于上业大生产的菌株多为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵杆菌和大肠杆菌等杆菌及其突变株【3】。

本文笔者主要从发酵培养基、培养条件和发酵过程的放大与优化等方面阐述了微生物发酵法生产赖氨酸的研究进展。

1培养基对发酵的影响1．1碳源在赖氨酸生产中，能够提供碳源的物质很多，有淀粉、糖蜜、葡萄糖、醋酸、苯甲酸、乙醇和烃类等，但是日前实现产业化的只有糖蜜、淀粉和醋酸三种原料路线。

ε-聚赖氨酸产生菌的筛选、育种及发酵研究ε-聚赖氨酸（ε-poly-Lysine，ε-PL）是少数链霉菌将L-赖氨酸单体通过α-COOH与ε-NH₂脱水缩合而成的一种氨基酸同聚物，聚合度为25-35。

由于其抑菌谱广、效价高、安全无毒，再配合其水溶性好、作用pH广、热稳定强等特点，ε-PL已被广泛用作食品防腐剂。

此外，ε-PL还被用于食疗剂、药物载体、基因芯片、电子材料等领域。

因此，其应用价值及市场前景是非常广阔的。

本论文首先从土壤中筛选获得了五种野生型的ε-PL产生菌；其次利用传统诱变方法及新兴的Genome Shuffling技术对这些野生菌株进行育种改造，以提升其ε-PL发酵水平；然后对获得的高产菌株进行了种间随机的原生质体融合，将其优良性状集中于同一个细胞内，进一步提升了ε-PL的产量；最后对种间融合获得的高产杂合子产ε-PL 进行了强化，包括Genome Shuffling、培养基优化及发酵工艺优化，最终使其ε-PL产量达到了国内领先水平。

具体研究内容如下：（1）从土壤中筛选放线菌时，为了有效抑制杂菌（细菌、霉菌）的生长，在分离培养基中添加了复合抑制剂：重铬酸钾30mg/L、青霉素2mg/L、氟哌酸3mg/L、制霉菌素80mg/L；对ε-PL 产生菌的筛选方法做了改进，利用“双层琼脂法”代替“直接添加美蓝”法，将“菌落生长”与“排斥美蓝显色”分成了两个阶段，能够有效避免美蓝对微生物的毒害，提高了筛选效率；利用该法从土壤中筛选获得了ε-PL产生菌42株，其中至少有白色链霉菌S. albulus、禾粟链霉菌S. graminearus、吸水链霉菌S. hygroscopicus、灰褐链霉菌S. griseofuscus、稠李链霉菌S. padanus等五种菌株，其中后四种菌株在ε-PL产生菌中未见报道。

（2）采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）对五种ε-PL产生菌进行诱变。

微生物产赖氨酸的研究进展收稿日期：2009-09-09基金项目：黑龙江省科技厅项目（GA07B401-5）作者简介：刘晓飞（1980-），女，博士研究生，研究方向为农业微生物。

E-mail:liuxiaofei72@ *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为生物化学与分子生物学。

E-mail:gaoxj5390@刘晓飞1，高学军1*，刘营2，敖金霞2，王青竹1（1.乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学，哈尔滨150030；2.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：赖氨酸是人和动物营养的9种必需氨基酸中的第一必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等领域。

发酵法是目前生产赖氨酸最主要的方法。

文章从赖氨酸的生产现状、生物合成途径、代谢调控，育种等方面阐述了微生物生产赖氨酸的研究进展。

关键词：赖氨酸；发酵；生物合成；代谢调控中图分类号：Q93-91文献标志码：A文章编号：1005-9369（2010）01－0157－04Research progress on microbial production of Lysine/LIUXiaofei 1,GAOXuejun 1,LIU Ying 2,AO Jinxia 2,WANG Qingzhu 1(1.Key Laboratory of Dairy Sciences ,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China ;2.Research Center of life Sciences and Biotechnique ,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China )Abstract:As one of the essential amino acids for human beings and animals,Lysine is widely usedin many fields,such as pharmaceutical,food and forage.The fermention is the frequently used method of Lysine production at present.This paper stated the research evolution focused on aspects of production situation,biosynthetic pathways,metabolic controland regulation and breeding of Lysine.Key words:Lysine;fermentation;biosynthesis;metabolic control and regulation 赖氨酸（Lysine ）的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型（左旋）、D-型（右旋）和DL 型（消旋）三种旋学异构体。

经典赖氨酸的发酵工艺赖氨酸是重要的氨基酸之一，其具有丝氨酸和蛋氨酸所不具备的特殊性质，是蛋白质合成的重要成分。

因此，赖氨酸在医药、生化工程、畜牧、保健品等领域有着广泛的应用。

本文将介绍赖氨酸的发酵工艺。

1、菌种选择赖氨酸的发酵常用的菌株有棒状杆菌、芽胞杆菌、嗜酸乳杆菌等。

其中棒状杆菌是目前应用最广泛的菌株，其产量和生长速度都比其他菌株高。

2、培养基配方赖氨酸的生产需要一种含有充分营养的发酵培养基。

肉汤培养基、玉米浆培养基、大豆蛋白水解物培养基等都可以作为赖氨酸发酵培养基的基础配方。

3、发酵条件发酵条件是影响赖氨酸产量的因素之一，包括pH值、温度、搅拌速度、氧气含量等。

常用的发酵条件为：温度37℃，pH6.5-7.0，搅拌速度300r/min，氧气含量5-20%。

4、发酵过程发酵过程分为批次发酵和连续发酵。

批次发酵一般分为四个阶段：生长、中期、后期和稳定期。

稳定期一般持续24-30小时，产生的赖氨酸稳定。

5、赖氨酸提取经过发酵过程，赖氨酸与其他细胞成分一起被培养基中的微生物细胞包裹着，无法直接获得。

因此，需要采用一些方法将赖氨酸从培养基中提取出来。

常用的提取方法有离子交换法、逆流萃取法、低分子量有机化合物萃取法等。

6、赖氨酸纯化提取出来的赖氨酸还需要进行进一步的纯化，以得到纯度高达98%以上的赖氨酸。

常用的纯化方法有凝胶过滤、离子交换、逆流色谱和气相色谱法等。

总之，赖氨酸的发酵工艺包括菌种选择、培养基配方、发酵条件、发酵过程、赖氨酸提取和赖氨酸纯化等步骤。

只有在严格控制各个条件的同时，才能得到高产、高纯度的赖氨酸。

第10卷第2期2012年3月生物加工过程Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol．10No．2Mar．2012doi ：10．3969/j．issn．1672－3678．2012．02．015收稿日期：2011－09－06基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）重大项目（2011AA02A205）作者简介：张军华（1962—），男，山东寿光人，高级工程师，研究方向：生物工程，E-mail ：zhang-junhua@cofco．com 微生物发酵法生产L -赖氨酸的研究进展张军华（中粮生化（安徽）股份有限公司，蚌埠233010）摘要：微生物发酵法是目前生产L -赖氨酸最主要的方法。

L -赖氨酸生物合成存在两个完全不同的途径：二氨基庚二酸途径和α-氨基己二酸途径；分别由不同的酶进行调节，控制L -赖氨酸的合成。

笔者概述了L -赖氨酸生产方法、生物合成途径以及合成中关键性酶的调节作用和国内外L -赖氨酸生产菌育种方法的研究进展。

关键词：L -赖氨酸；生物合成；酶；调控；育种中图分类号：TQ922+．3文献标志码：A 文章编号：1672－3678（2012）02－0073－06Research progress on microbial fermentation of L -lysineZHANG Junhua（COFCO Biochemical （Anhui ）Co．，Ltd．，Bengbu 233010，China ）Abstract ：Fermentation was the mainly used method of L -lysine production presently．There were two completely different biosynthesis pathways of L -lysine ：heptanedioic acid pathway ，and α-amino hexaned-ioic acid pathway．Different enzymes were used to regulate the two pathways and control the synthesis of L -lysine．In this paper ，production methods of L -lysine ，biosynthetic pathways as well as the regulations of the key enzymes ，and the research evolution of the breeding of L -lysine hyper-producer were summa-rized at home and abroad．Key words ：L -lysine ；biosynthesis ；enzyme ；regulation ；breeding 赖氨酸（lysine ）的化学名称为2，6-二氨基己酸，分子式为C 6H 14N 2O 2［1］。

ZL-9601赖氨酸生产菌某些特性及发酵试验的研究2006-1-5 14:52:38 新闻来源：农业生物技术学报李秀锦仲飞刘绍军常学东孙树杰赵彦波冀振华(河北农业技术师范学院，昌黎066600)摘要：本研究对ZL-9601赖氨酸生产菌菌株的形态、培养特性和生理生化特性进行了初步鉴定和分析，并以糖蜜为主要原料，初步确定了该菌的产酸能力。

结果表明，该菌为短杆菌(0.8～1.0×1.0～2.5μm), 需氧, 发酵最适温度30℃, 最适pH7.0～7.2, 最适碳源为葡萄糖, 最适氮源为硫酸铵; 该菌不分解赖氨酸, 可耐15%的赖氨酸, 耐30%的葡萄糖。

以糖蜜为主要原料, 在最适温度和pH的条件下, 产酸可达6%以上。

关键词: ZL-9601菌种；赖氨酸；发酵；菌种特征赖氨酸是人和多种动物的必需氨基酸。

在谷类食品和饲料中添加适量赖氨酸可提高这类食品或饲料中蛋白质的营养价值。

目前, 在国内外市场上, 赖氨酸的需求量日益增加, 培育赖氨酸高产菌株和研究最佳发酵工艺条件便受到人们的普遍重视［1～4 ］, 许多高产菌株陆续被选育出来［5～8］。

如国内选育的TL-1菌株产酸量为4.5% 。

为进一步提高赖氨酸的产量, 人们又在这些菌种的基础上通过各种选育过程得到更高产的菌株［9］。

如ZL-9601赖氨酸生产菌株就是由谷氨酸棒杆菌AS1.563通过进一步诱变处理选育出的高产菌株。

本研究主要就ZL-9601菌株的形态、培养特性和生理生化特性进行了初步鉴定和分析，并以糖蜜为主要原料进行发酵试验, 旨在为实际生产确定最佳发酵条件提供科学依据。

1材料与方法1.1菌种ZL9601菌株由河北农业技术师范学院食品生化实验室选育。

该菌为谷氨酸棒杆菌AS 1.563 (中科院微生物所提供)的诱变株，遗传标记为AECr, Hom-。

1.2主要培养基1.2.1斜面种子培养基牛肉膏1.1%, 蛋白胨1.0%, 葡萄糖0.5%, NaCl 0.5%, 琼脂0.2%, pH7.0, 在0.14mpa压力下灭菌20min, 后置于37 ℃培养箱培养24h, 备用。

江南大学科技成果——微生物发酵生产L-赖氨酸
成果简介
选育高产菌种和发展赖氨酸生产对于提高食品中蛋白质利用率,增强人民体质以及发展家禽饲养业等具有十分重要的意义,对于以谷物为主要食物的我国尤为重要。

本实验室通过诱变选育和基因工程手段对大肠杆菌进行改造，获得一株高产赖氨酸生产菌株，发酵培养36h，赖氨酸盐酸盐产量高达193g/L，葡萄糖得率为74%左右。

关键技术
本研究以玉米浆为氮源，有效的降低了发酵成本；以葡萄糖为原料生产L-脯氨酸的高转化率发酵，该法绿色、环保、可持续，具有经济竞争力，有很好的产业应用前景；以大肠杆菌为宿主，不仅缩短了发酵周期，而且也降低了染菌几率。

知识产权
一株产L-赖氨酸的大肠杆菌及其应用，CN201911370748.X。

项目成熟度
试生产阶段
投资期望及应用情况
投资期望：根据目前技术水平，初步估算生产综合成本约6.6万元/吨，目前市场定价约为12万元/吨。

以1000吨生产规模计算，毛利润可达5400万元/年。

应用情况：L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的8种必需氨基酸中最重要的一种，应用于食品强化剂和饲料添加剂，也用于医药。

ε-聚赖氨酸产生菌的育种、发酵及高产机制的初步生理解析ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是一种由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH₂脱水缩合而成的天然高分子聚合物。

由于其易溶于水、对热稳定、可被生物降解、抑菌谱广泛、安全性高和临床疗效良好等优点,ε-PL被作为食品防腐剂、药物载体、食疗剂、乳化剂和水凝胶等在日本、韩国、美国和中国等国家广泛应用。

本文以Streptomyces sp.G67为出发菌株,首先利用多轮复合诱变、基因组重排结合核糖体工程,依次筛选出了的单重和多重抗性突变株菌,大幅提高了ε-PL摇瓶产量,并从生理角度解释了高产机制。

随后,构建并比较了高产菌与原始菌的ε-PL合成代谢途径,进一步分析了高产机制。

最终建立了一种具有工业化应用潜力的酸性pH冲击-溶氧调控策略（PS-PAD）,并考察了该策略在5 L补料-分批发酵过程中引起的生理变化。

具体研究内容如下:（1）紫外（UV）、常温常压等离子体（ARTP）和甲基磺酸乙酯（EMS）诱变三种方法中,ARTP和EMS的诱变效果明显好于UV诱变,因此选择这两种方法对G67进行复合诱变。

六种作用于核糖体的抗生素中,只有与核糖体工程相关的链霉素、庆大霉素和利福霉素抗性能提高ε-PL产量,其中链霉素抗性（Str^r）菌ε-PL 产量提高幅度最大,故选择链霉素作为复合诱变的抗性标记。

经过3轮“复合诱变+Str^r”筛选,获得了单重抗性高产菌GS-1,摇瓶产量由1.9 g·L^-1提高到2.81 g·L^-1,提高了47.9%。

扩增片段长度多态性（AFLP）分析表明“复合诱变+Str^r”的育种方法能增加突变株的基因多态性,促使其ε-PL产量的快速提高。