PCR ● 增加了对不可培养微生物生理、生化和关键代谢机理的了解
DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同,
过程 (2)重组DNA分子导入受体细胞要方便。
以cDNA第一链和第二链为模板,用上、下游引物进行PCR扩增 目标DNA和载体浓度的确定 oligo(dT)-纤维素柱层析分离法 性,即形成可逆的瞬时通道,二ming recombination,RPR) 第一节 PCR扩增法获得目的基因
特点 设计两条引物GSP1和GSP2,GSP1在GSP2的外侧,以第三步中形成的杂合体为模板,利用引物GSP1为反转录引物合成cDNA第一
链
Strand ExchangeMutagenesis)
运用杂交的二级动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA,从而使得丰度有差别的单链
(正义引物) AGSP:基因特异引物
(反义引物)
盒式P CR原 理示 意图
5. RACE
rapid-amplification of cDNA ends
第一节 PCR扩增法获得目的基因
通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增, 得到基因转录本的未知序列,从而获得mRNA完 整序列的方法
过程和分类
方法 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否
已超螺旋状态存在,分离抽提比YAC容易 高 重叠延伸PCR 法(Over-lap extension PCR )
反向PCR 以cDNA第一链和第二链为模板,用上、下游引物进行PCR扩增
第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性,降解RNA;
TAP处理全长的mRNA,去掉其帽子结构,保留 5’端的一个磷酸基团
设计锚定序列,具OP和IP区,用T4 RNA连接 酶,将具有锚定序列的一段短RNA寡核苷酸与 去掉帽子结构的mRNA进行连接