IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法

.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。

polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。

.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。

当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。

聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。

以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。

2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。

这通常需要约30分钟至1小时。

3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。

这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。

4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。

5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。

根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。

6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。

通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。

7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。

请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。

同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。

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(6)剪取加样纸:
按坐标纸的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加样纸,拨去上
下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度
调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层).
(7)加样:
将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的
凝胶中央.
(8)连接电极:
将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂
带。
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4
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2.3.两性电解质 (1) Ampholine(瑞典LKB) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组 成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.
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(2) Servalyte(德国Serva公司) 它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺 混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.
金丝压在电极条上.盖上安全可编罩辑p,p接t 通冷凝水.
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(9)电泳:
将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连, 负极输出端与
NaOH电极条相连,接通电源,60V恒压15min, 8mA恒流至
电压上升到 550V,关闭电源,揭去加样纸, 然后在550V恒
压3小时左右,等电流降至接近于零,停止电泳.
(10)固定:
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3.2pH梯度的形成过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度 而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm， 凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质, 电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图

等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。

该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。

IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。

样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。

当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。

这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。

IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。

实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。

通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。

二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。

近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。

目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。

由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。

蛋白质分子是典型的两性电解质分子。

它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。

这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。

如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。

这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。

等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。

两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。

常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。

国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。

两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。

聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。

以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。

其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。

2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。

接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。

3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。

用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。

然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。

4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。

在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。

5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。

用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。

6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。

常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。

银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。

7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。

常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。

乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。

8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。

银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。

等电聚焦示意图
双向电泳示意图
双向电泳图谱
电泳装置
操
1. 凝胶柱的制备
作
方 法
（1）玻璃管先用小片的封口膜封口，然后将封口的一端插在 橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中 先加2-3滴30%的甘油或者40%蔗糖) （2）配胶 （按照黑板上的配方加入相应的溶液） 表 凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 30%凝胶贮存液 1.3 ml 蒸馏水 1.9 ml 2mg/ml蛋白质样品 1.5 ml 40%两性电解质载体 0.48 ml TEMED 0.004 ml 充分混匀后 加入10%过硫酸铵 0.04 ml
理想的载体两性电解质的合成
用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六 胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合 反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比 例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机合成 不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求 合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证 的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑 的pH梯度。 载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在 300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性 能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好， 在1%水溶液中的紫外吸收值（260nm）很低。
解
疑
1、在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 答： 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到 所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系 的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 2、为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 答：等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值 区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电 解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。

聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。

它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。

近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。

由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。

这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。

本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。

常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。

合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。

这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。

混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。

目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。

不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。

（2）在正极端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液， 如氢氧化钠、氨水等。
（3）电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH 相等，用pH0表示。
（4）电泳开始后，混合物中pI最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等 电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH 突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在 此区域内。
IEF-PAGE
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) • 两性电解质和pH梯度的形成 • pH梯度的测定 • 样品等电点的计算
IEF-PAGE原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric FocusingPAGE，简称IEF-PAGE)原理： （1）两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载 体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的 平滑和连续的pH梯度。 （2）在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移 至周围的pH值等于该蛋白质的等电点处时，蛋白质此时不 带电荷，停止泳动，进而被浓缩成狭窄的区带。 （3）常用的pH梯度电泳支持物有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝 胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。支 持物的作用是为了防止在正负极之间形成对流。
载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在 300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性 能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好， 在1%水溶液中的紫外吸收值（260nm）很低。
两性电解质在电流的作用下现场平滑的pH梯度
（1）正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物（即 在灌制聚丙烯酰胺凝胶的时候将两性电解质加到未聚合的凝胶中，聚 合后，在凝胶中即形成了两性电解质的混合物）；

在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
等电聚焦电泳（Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing）是一种电泳方法，即利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在凝胶常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。

双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。

这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。

这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。

一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。

而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。

②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。

③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。

④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。

⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。

⑥以大约6500×g离心5分钟。

⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。

⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。

二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。

1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。

因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。

脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。

充分溶解后，离心去除不溶杂质。

2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。

3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。

聚丙烯酰胺电泳的操作要点
聚丙烯酰胺电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和
分析生物大分子的方法。

它可以根据分子的大小、电荷、形状等特性，将混合物中的生物大分
子分开。

以下是关于聚丙烯酰胺电泳操作的一些要点：
1. 准备电泳胶：首先准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过在甲醛和丙烯酰胺溶液中聚合产生的。

将混合好的聚合液注入电泳模具中，并固化成胶体。

可以根据需要控制凝胶的浓度和模具的尺寸，以适应不同的样品。

2. 准备样品：将待分析的样品制备成均匀浓度的溶液。

通常会加入一些缓冲液和上样缓冲液来
调节样品的pH值和离子浓度，以提高电泳的效果。

3. 进行电泳：将固化好的凝胶放入电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液。

将样品通过吸管或微量
注射器等工具均匀地加在凝胶上。

根据需要，可以设置正负电极以及电场的强度。

4. 分离和成像：通电后，生物大分子将在电场作用下向电极移动。

根据分子的大小和电荷，它
们会在凝胶中以不同的速度移动。

较小的分子会移动得较快，反之，较大的分子移动较慢。

一
般可以根据需要选择不同的电泳时间，以获得最佳的分离和分辨率。

完成电泳后，可以使用染
色剂、荧光探针等方法，将分离的带状物可视化，并进行成像和分析。

总结来说，聚丙烯酰胺电泳是一种基于电场作用，利用聚丙烯酰胺凝胶分离生物大分子的方法。

操作时需要准备好电泳胶和样品，并在电泳槽中设置合适的条件。

通过电泳过程，可以根据分
子的大小和电荷，实现对样品中生物大分子的分离和分析。

【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法【实验原理】等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。

当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。

蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。

当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。

当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。

这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。

利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。

【实验材料】1.实验器材小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计2.实验试剂(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。

(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。

此蛋白溶液应无盐离子。

(3) 5%磷酸溶液(4) 2%氢氧化钠溶液(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。

(6) 40%蔗糖溶液(7) 12%三氯醋酸溶液(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。

【实验操作】1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。

2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。

聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
1.清洗电泳仪和电泳板。

2.准备实验用液，将需要的磷酸缓冲液和聚丙烯酰胺溶液以及添加的阳离子
表面活性剂混合均匀。

3.调节电泳仪的温度、电压、时间等参数。

4.垂直安装电泳板，将电泳板安装在电泳支架中，保证其处于垂直位置。

5.将溶液添加到电泳板，并将电泳板放入电泳仪中进行实验，注意实验过程
中溶液的变化，以便及时调节电泳仪参数。

6.实验完毕后取出电泳板，用纸巾擦拭干净，重复上述实验步骤，直至所有
实验完毕。

7.染色及脱色，电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染
色1小时以上。

染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。

置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。

此时改用7%醋酸充装在液槽中。

通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。

在我们的试验中省略的染料泳向正极。

脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。

3-4小时脱色完毕。

有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。

pH梯度的建立
IEF-PAGE的优点和应用
优点：分辨率高（0.01pH），抵消扩散作用，可使很稀的样品达到高度 的浓缩，并同时测定等电点。特别适合于分离分子量相近而等电点 不同的蛋白质组分 。 缺点：1、聚焦要求用无盐溶液，在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀， 2、样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶 或发生变性的蛋白质。 应用：1、分析和制备。 2、测定等电点。 注意：有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。蛋白质应不含 盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸碱， 占据了分离的有效部位。色素和酚类物质也会影响结果。同时要加 入蛋白质水解的抑制剂。此外，两性电解质的好坏是聚焦好坏的关 键之一。加样体积不受限制，最高可达80-85毫升。
1、分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 2、可溶性好，便于等电聚焦过程中pH梯度的形成和蛋白质样品的迁移。 3、缓冲能力强，避免聚焦的蛋白质在等电点引起pH梯度的局部改变和溶 解性能的下降。 4、导电性均匀，排除电场的不均匀而导致凝胶局部过热。 5、紫外吸收低，不发荧光。 6、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组 成不同于蛋白质。
影响等电聚焦的因素
7、样品与处理与加样的方法： 样品预处理：盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。 为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用 SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液 中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。 加样量的确定：加样量则取决于样品中蛋白质的种类、 数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色， 加样量可为50-150 g；如用银染色，加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积 为10-30 l。 8、电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染 色剂也能和两性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在 10%-15％的三氯乙酸中去除两性电解质，然后再以适当 的方法染色。我们使用的是改良的考马斯亮蓝染液，染色 的同时进行脱色。