表达结核杆菌ESAT_6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
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１ 材料和方法 １．１ 质粒、菌株与细胞株
大 肠 杆 菌－ 分 枝 杆 菌 穿 梭 表 达 质 粒 ｐＭＶ２６１ 由 四川大学生命科学学院徐恒副教授惠赠。耻垢分枝杆 菌 ｍｃ２１５５ 国际标准株由北京结核病防治所提供。结 核分枝杆菌 Ｈ３７Ｒｖ 国际标准株由中国药品生物制品 检定所提供。大肠杆菌 ＤＨ５α、小鼠骨髓巨噬细胞株 ＡＮＡ－１ 由本室保存。 １．２ 生化试剂与培养基
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＥＳＡＴ－６ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＥＳＡＴ－６ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ Ｅ． ｃｏｌｉ－ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＨＳＰ６０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ， ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ＡＮＡ－１ ｗａｓ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ． Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＡＮＡ－１ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＲＴ－ＰＣＲ）． Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＡＮＡ－１ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ＥＳＡＴ－６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｖａｌｕｅ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＥＳＡＴ－６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ＡＮＡ－１ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｆｏｒ ４ ｔｏ ２４ ｈ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｉＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ＣＦＵ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ＡＮＡ－１ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＥＳＡＴ－６ ｇｅｎｅ ｐｏｓｓｅｓｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ＥＳＡＴ－６； Ｅ．ｃｏｌｉ－ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ； ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ； ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
呈现上升趋势［１］。据 ＷＨＯ 统计报告， 全球结核病年 发病率正以 ０．４％的速度增长， 每年约有（ ２００￣３００） 万 人死于结核病， 其人数是其它传染病死亡人数的总 和。卡介苗（ ＢＣＧ） 作为目前用于预防结核病的唯一 疫苗， 对结核病的保护效力在不同人群中存在显著差 异（ ０￣８０％） ， 因而亟需寻找一种更为有效的结核病疫 苗 ［ ２］ 。耻 垢 分 枝 杆 菌 是 一 种 快 速 生 长 的 非 致 病 性 分 枝 杆菌， 其遗传背景与结核分枝杆菌类似， 并且是一种 有效的细胞免疫佐剂， 因此耻垢分枝杆菌是研究结核 杆菌基因功能和构建新型结核疫苗的理想宿主菌。
Ｃｏｎｓｔｒ ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｎｇ ＥＳＡＴ－６ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｍａｃｒ ｏｐｈａｇｅｓ
ＬＩ Ｙａｎ， ＢＡＯ Ｌａｎｇ， ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｄｏｎｇ， ＬＩ Ｙａ－ｓｈａ， ＺＨＵ Ｈａｉ－ｌｏｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ
经 ＢａｍＨⅠ／ＥｃｏＲⅠ双酶切和 ＰＣＲ 初步鉴定后， 送大 连宝生物公司测序。 １．５ 耻垢分枝杆菌的电转化
取培养至对数生长期（ Ｄ６００ 约 ０．５） 的耻垢分枝杆 菌 ｍｃ２１５５， 以冰冷的 １０％甘油洗涤 ４ 次， 制备耻垢分 枝杆菌感受态 细 胞 。 取 ４００ μｌ 感 受 态 细 胞 加 入 ０．５ μｇ 重组穿梭质粒 ｐＭＶ－ＥＳＡＴ６， 以空白质粒 ｐＭＶ２６１ 作为对照。冰浴 ３０ ｍｉｎ， 转入预冷的 ２ ｍｍ 电穿孔杯 中， 在 ２．５ ｋＶ、５０ μＦ、７２０ Ω条件下电穿孔。放电完毕 后 立 即 冰 浴 １０ ｍｉｎ， 将 穿 孔 后 的 细 菌 涂 布 于 含 ２０ μｇ／ｍｌ 卡那霉素的 ＬＢ 平板， ３７ ℃静置培养 ３￣４ ｄ， 筛 选阳性克隆。 １．６ ＥＳＡＴ－６ 基因在耻垢分枝杆菌中的诱导表达
Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ、Ｔ４ ＤＮＡ 连接试剂盒购 自 Ｔａｋａｒａ 公司。限制性核酸内切酶 ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ， ＤＮＡ 分子量标准为 ＭＢＩ 公司产品。ＰＣＲ 产物纯化试 剂盒， 胶回收试剂盒购自上海华舜公司。Ｔｒｉｚｏｌ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 合成 试剂盒购自 ＭＢＩ 公司。酵母提取物、胰蛋白胨购自 ＯＸＯＩＤ 公司。ＲＰＭＩ １６４０ 培养基购自 Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ 公 司、优级新生牛血清购自民海生物工程有限公司。 １．３ 结核分枝杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因的克隆
根 据 ＥＳＡＴ－６ 基 因 编 码 序 列 设 计 引 物 ， 上 游 ： ５＇－ＴＡＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＧ －３＇， 含 有 ＢａｍＨⅠ酶 切 位 点 ， 下 游 ： ５＇－ＴＡＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＧＣ ＧＡＡ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＧＴ－３＇， 含 ＥｃｏＲⅠ酶切位 点。参照文献方法［４］ 提取结核分支杆菌 Ｈ３７Ｒｖ 基因 组 ＤＮＡ， 以之为模板进行 ＰＣＲ 扩增， 获得 ＥＳＡＴ－６ 基因。ＰＣＲ 循环参数为： ９４ ℃预变性 ３ ｍｉｎ， ９４ ℃变性 ４５ ｓ， ５８ ℃复性 １ ｍｉｎ， ７２℃延伸 ３０ ｓ， 共循环 ３０ 次， 最后 ７２ ℃延伸 ７ ｍｉｎ。 １．４ 重组质粒的构建
２００６；２６（７）
南方医科大学学报（Ｊ Ｓｏｕｔｈ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ）
· ９２３ ·
表达结核杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
李 岩， 鲍 朗， 张会东， 李娅莎， 朱海龙（ 四川大学华西医学中心基础与法医学院感染免疫研究室， 四川 成都 ６１００４１）
摘要： 目的 构建表达结核分枝杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法 采用 ＰＣＲ 技术 克 隆 结 核 分 枝 杆 菌 ＥＳＡＴ－６ 基 因 ， 构 建 大 肠 杆 菌－ 分 枝 杆 菌 穿 梭 表 达 质 粒 ｐＭＶ－ＥＳＡＴ６， 经 酶 切 分 析 和 ＤＮＡ 测 序 证 实 连接片断的正确性后， 用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌 ｍｃ２１５５ 中。以 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检测 ＥＳＡＴ－６ 蛋白在重组 耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞 ＡＮＡ－１， 半定量 ＲＴ－ＰＣＲ 检测 ＡＮＡ－１ 细胞诱导型一 氧化氮合酶（ ｉＮＯＳ） 表达水平， 裂解巨噬细胞， 计数胞内存活细菌数。结果 重组耻垢分枝杆菌构建成功， 经热诱导后可以 表达相对分子质量约为 ６０００ 的蛋白， 与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导 ＡＮＡ－１ 细胞活化表达 ｉＮＯＳ， 并增强 巨噬细胞的杀伤活性， 重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（ Ｐ＜０．０５） 。结论 表达结核分枝杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因的 重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性， 为构建新型结核疫苗提供了实验基础。 关键词： ＥＳＡＴ－６； 大肠杆菌－ 分枝杆菌穿梭质粒； 重组耻垢分枝杆菌； 巨噬细胞 中图分类号： Ｒ３７８．９１１ 文献标识码： Ａ 文章编号： １６７３－４２５４（ ２００６） ０７－０９２３－０４
大 肠 杆 菌－ 分 枝 杆 菌 穿 梭 表 达 质 粒 ｐＭＶ２６１ 由 四川大学生命科学学院徐恒副教授惠赠。耻垢分枝杆 菌 ｍｃ２１５５ 国际标准株由北京结核病防治所提供。结 核分枝杆菌 Ｈ３７Ｒｖ 国际标准株由中国药品生物制品 检定所提供。大肠杆菌 ＤＨ５α、小鼠骨髓巨噬细胞株 ＡＮＡ－１ 由本室保存。 １．２ 生化试剂与培养基
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＥＳＡＴ－６ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＥＳＡＴ－６ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ Ｅ． ｃｏｌｉ－ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＨＳＰ６０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ． Ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ， ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ＡＮＡ－１ ｗａｓ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ． Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＡＮＡ－１ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＲＴ－ＰＣＲ）． Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＡＮＡ－１ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ＥＳＡＴ－６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｖａｌｕｅ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＥＳＡＴ－６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ＡＮＡ－１ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｆｏｒ ４ ｔｏ ２４ ｈ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｉＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ＣＦＵ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ＡＮＡ－１ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＥＳＡＴ－６ ｇｅｎｅ ｐｏｓｓｅｓｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ＥＳＡＴ－６； Ｅ．ｃｏｌｉ－ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ； ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ； ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
呈现上升趋势［１］。据 ＷＨＯ 统计报告， 全球结核病年 发病率正以 ０．４％的速度增长， 每年约有（ ２００￣３００） 万 人死于结核病， 其人数是其它传染病死亡人数的总 和。卡介苗（ ＢＣＧ） 作为目前用于预防结核病的唯一 疫苗， 对结核病的保护效力在不同人群中存在显著差 异（ ０￣８０％） ， 因而亟需寻找一种更为有效的结核病疫 苗 ［ ２］ 。耻 垢 分 枝 杆 菌 是 一 种 快 速 生 长 的 非 致 病 性 分 枝 杆菌， 其遗传背景与结核分枝杆菌类似， 并且是一种 有效的细胞免疫佐剂， 因此耻垢分枝杆菌是研究结核 杆菌基因功能和构建新型结核疫苗的理想宿主菌。
Ｃｏｎｓｔｒ ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｎｇ ＥＳＡＴ－６ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｍａｃｒ ｏｐｈａｇｅｓ
ＬＩ Ｙａｎ， ＢＡＯ Ｌａｎｇ， ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｄｏｎｇ， ＬＩ Ｙａ－ｓｈａ， ＺＨＵ Ｈａｉ－ｌｏｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ
经 ＢａｍＨⅠ／ＥｃｏＲⅠ双酶切和 ＰＣＲ 初步鉴定后， 送大 连宝生物公司测序。 １．５ 耻垢分枝杆菌的电转化
取培养至对数生长期（ Ｄ６００ 约 ０．５） 的耻垢分枝杆 菌 ｍｃ２１５５， 以冰冷的 １０％甘油洗涤 ４ 次， 制备耻垢分 枝杆菌感受态 细 胞 。 取 ４００ μｌ 感 受 态 细 胞 加 入 ０．５ μｇ 重组穿梭质粒 ｐＭＶ－ＥＳＡＴ６， 以空白质粒 ｐＭＶ２６１ 作为对照。冰浴 ３０ ｍｉｎ， 转入预冷的 ２ ｍｍ 电穿孔杯 中， 在 ２．５ ｋＶ、５０ μＦ、７２０ Ω条件下电穿孔。放电完毕 后 立 即 冰 浴 １０ ｍｉｎ， 将 穿 孔 后 的 细 菌 涂 布 于 含 ２０ μｇ／ｍｌ 卡那霉素的 ＬＢ 平板， ３７ ℃静置培养 ３￣４ ｄ， 筛 选阳性克隆。 １．６ ＥＳＡＴ－６ 基因在耻垢分枝杆菌中的诱导表达
Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ、Ｔ４ ＤＮＡ 连接试剂盒购 自 Ｔａｋａｒａ 公司。限制性核酸内切酶 ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ， ＤＮＡ 分子量标准为 ＭＢＩ 公司产品。ＰＣＲ 产物纯化试 剂盒， 胶回收试剂盒购自上海华舜公司。Ｔｒｉｚｏｌ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 合成 试剂盒购自 ＭＢＩ 公司。酵母提取物、胰蛋白胨购自 ＯＸＯＩＤ 公司。ＲＰＭＩ １６４０ 培养基购自 Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ 公 司、优级新生牛血清购自民海生物工程有限公司。 １．３ 结核分枝杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因的克隆
根 据 ＥＳＡＴ－６ 基 因 编 码 序 列 设 计 引 物 ， 上 游 ： ５＇－ＴＡＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＧ －３＇， 含 有 ＢａｍＨⅠ酶 切 位 点 ， 下 游 ： ５＇－ＴＡＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＧＣ ＧＡＡ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＧＴ－３＇， 含 ＥｃｏＲⅠ酶切位 点。参照文献方法［４］ 提取结核分支杆菌 Ｈ３７Ｒｖ 基因 组 ＤＮＡ， 以之为模板进行 ＰＣＲ 扩增， 获得 ＥＳＡＴ－６ 基因。ＰＣＲ 循环参数为： ９４ ℃预变性 ３ ｍｉｎ， ９４ ℃变性 ４５ ｓ， ５８ ℃复性 １ ｍｉｎ， ７２℃延伸 ３０ ｓ， 共循环 ３０ 次， 最后 ７２ ℃延伸 ７ ｍｉｎ。 １．４ 重组质粒的构建
２００６；２６（７）
南方医科大学学报（Ｊ Ｓｏｕｔｈ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ）
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表达结核杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究
李 岩， 鲍 朗， 张会东， 李娅莎， 朱海龙（ 四川大学华西医学中心基础与法医学院感染免疫研究室， 四川 成都 ６１００４１）
摘要： 目的 构建表达结核分枝杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法 采用 ＰＣＲ 技术 克 隆 结 核 分 枝 杆 菌 ＥＳＡＴ－６ 基 因 ， 构 建 大 肠 杆 菌－ 分 枝 杆 菌 穿 梭 表 达 质 粒 ｐＭＶ－ＥＳＡＴ６， 经 酶 切 分 析 和 ＤＮＡ 测 序 证 实 连接片断的正确性后， 用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌 ｍｃ２１５５ 中。以 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 检测 ＥＳＡＴ－６ 蛋白在重组 耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞 ＡＮＡ－１， 半定量 ＲＴ－ＰＣＲ 检测 ＡＮＡ－１ 细胞诱导型一 氧化氮合酶（ ｉＮＯＳ） 表达水平， 裂解巨噬细胞， 计数胞内存活细菌数。结果 重组耻垢分枝杆菌构建成功， 经热诱导后可以 表达相对分子质量约为 ６０００ 的蛋白， 与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导 ＡＮＡ－１ 细胞活化表达 ｉＮＯＳ， 并增强 巨噬细胞的杀伤活性， 重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（ Ｐ＜０．０５） 。结论 表达结核分枝杆菌 ＥＳＡＴ－６ 基因的 重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性， 为构建新型结核疫苗提供了实验基础。 关键词： ＥＳＡＴ－６； 大肠杆菌－ 分枝杆菌穿梭质粒； 重组耻垢分枝杆菌； 巨噬细胞 中图分类号： Ｒ３７８．９１１ 文献标识码： Ａ 文章编号： １６７３－４２５４（ ２００６） ０７－０９２３－０４
